[发明专利]光镜-透射电镜联用样品处理试剂及CLEM检测方法

说明书

本发明提供一种光镜‐透射电镜联用样品处理试剂，包括固定剂、包埋剂：亲水性碱性树脂GMA、硼氢化钠、细胞核荧光染料和透射电镜染料，并利用提供的光镜‐透射电镜联用样品处理试剂进行CLEM检测的方法，通过样品固定、去除背景荧光、样品脱水、渗透、包埋、聚合、超薄切片、激光共聚焦显微镜成像、透射电镜图像获取以及后期图像处理完成。本发明解决了现有方法难以兼容荧光信号和样品细胞结构的保存的问题，样品具有较强的荧光信号并能同时保留完好的超微结构信息，采用图像归一方法简单有效，可方便的将已有的荧光显微镜与透射电镜联用，以获得高一致性的光镜‐电镜联用图像，本发明结合了目标分子的定位信息及超微结构信息，非常实用。

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂及利用该试剂进行CLEM检测的方法。

背景技术

了解目标细胞、细胞器的精确结构信息、以及目标蛋白在细胞内的定位及对结构的影响，可以为研究生长、发育、生殖、学习记忆、信号转导、免疫反应、新陈代谢等生命活动提供必要的信息。单独应用荧光显微技术无法获得样品的结构信息，而研究蛋白质的精确定位的免疫胶体金标记电镜技术受限于抗原决定簇难以保存、抗体难以进入树脂而标记成功率低，非特异性背景高等问题，难以被广泛使用而日渐被可同时展现目标细胞、蛋白的荧光信号与细胞内丰富的结构信息光镜-电镜联用(Correlative Light-and ElectronMicroscopy，CLEM)技术所取代。光镜-电镜联用技术方案是先在荧光显微观察体系下获取荧光信号定位信息，之后对样本进行电子着色，转移至电子显微镜体系观察，再根据荧光-电镜定位参照体系提供的位置信息，使用图像处理软件将荧光与图像与电子显微镜图像对应重合，同时获得目标细胞、细胞器或蛋白的定位和超微结构信息。

光镜-电镜联用技术方案中，包埋后荧光观察的方法先对样品进行固定、脱水、渗透、包埋处理，再对完全一致的样品观察荧光信号、电镜图像，具有更高的一致性，可获得较精确的结果，但一方面样品制备技术难以兼容荧光信号和样品细胞结构的保存，包埋后样品信号获得时的超薄片层荧光信号非常弱，结构信息亦不理想；另一方面整合的光镜-电镜设备尚未普及。怎样在包埋后的样品上同时保留良好的荧光信号并维持好的超微结构，并建立便捷稳定的图像归一方法以利用已有荧光显微镜及电子显微镜成为急需解决的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，包括固定剂：戊二醛、包埋剂、硼氢化钠、细胞核荧光染料和透射电镜染料。

进一步地，所述固定剂为2.5％戊二醛或4％多聚甲醛与0.5％戊二醛混合的固定剂，其中优选为2.5％戊二醛。2.5％戊二醛作为固定剂，样品细胞超微结构保留效果最好。

所述包埋剂为亲水性碱性树脂GMA；

进一步地，所述细胞核荧光染料为吖啶橙(Acridine Orange，AO)、碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)、Diaminophenylindole(DAPI)、Hoechst染料、EthD III、7-AAD或RedDot2中的一种。

进一步地，所述透射电镜染料为醋酸铀和柠檬酸铅。

本发明的另一个目的是提供利用所述的光镜-透射电镜联用样品处理试剂进行CLEM检测的方法，通过以下步骤实现：

(1)样品固定：带荧光蛋白标记的样品以固定剂于4-8℃固定不少于4小时；

(2)去除背景荧光：4-8℃下，步骤(1)的样品以0.5％的硼氢化钠的磷酸缓冲盐溶液(PBS)处理不少于5分钟，以去除背景荧光；

(3)样品脱水、渗透、包埋、聚合：4-8℃下，样品脱水、-20℃用包埋剂(亲水性碱性树脂GMA)渗透、包埋、聚合；

(4)超薄切片：样品经超薄切片机切片，以坐标铜网捞取超薄切片样品，便于初步定位目标荧光信号所在区域；