[发明专利]光镜-透射电镜联用样品处理试剂及CLEM检测方法

权利要求书

1.一种包埋后CLEM的检测方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）样品固定：带荧光蛋白标记的样品以固定剂于4-8℃固定不少于4小时；（2）去除背景荧光：4-8℃下，步骤（1）的样品以0.5%的硼氢化钠的磷酸缓冲盐溶液处理不少于5分钟，以去除背景荧光；

（3）样品脱水、渗透、包埋、聚合：4-8℃下，样品脱水、-20℃用包埋剂渗透、包埋、聚合；所述样品是以亲水性碱性树脂GMA作为包埋剂渗透、包埋、聚合的步骤为以70% 、85%、100%GMA于-20℃依次处理样品；换新的100% GMA 后，于−20℃再处理60分钟；换新的100% GMA后，−20℃渗透过夜，再将样品转移至100% GMA中，以低温紫外聚合仪于−20℃ 聚合不少于72小时；脱水步骤为分别以50%、70%、95% 乙醇于4-8℃脱水处理样品；

（4）超薄切片：样品经超薄切片机切片，以坐标铜网捞取超薄切片样品；

（5）细胞核荧光染色：以细胞核荧光染料对坐标铜网上的超薄切片进行细胞核染色，是以DAPI水溶液对超薄切片的细胞核进行荧光染色；

（6）激光共聚焦显微镜成像：经荧光观察，在激光共聚焦显微镜下找到目标细胞结构和细胞，记录其所在的坐标铜网格的位置；

（7）电子着色：经步骤（5）观察后的位于坐标铜网上的超薄切片样品以透射电镜染料染色；是将激光共聚焦拍摄完毕的带铜网玻片置于清水中，划开封片剂，去除盖玻片，取出铜网，室温以4%醋酸铀染色、Reynolds’柠檬酸铅染色；

（8）透射电镜图像获取：以透射电镜低倍寻找到目标区域所在铜网格，以高倍拍摄其超微结构，获得其超微结构；

（9）后期图像处理，利用细胞核荧光染料所标记细胞核，与透射电子显微镜下细胞核图像进行重合，同时获得目标荧光信号的定位以及超微结构信息；具体为在Photoshop软件中打开荧光图像和电镜图像，新建图像，其像素高、宽度大于荧光/电镜图像的120%，依次复制粘贴电镜图像、荧光图像，成为不同图层，并进行透明化、形变处理，以细胞核为参照，进行光镜、电镜图像处理归一，同时得到EYFP所标示的荧光信号的定位以及超微结构信息；

所述固定剂为2.5%戊二醛；所述包埋剂为亲水性碱性树脂GMA；所述细胞核荧光染料为吖啶橙、溴化乙锭、碘化丙啶、DAPI、Hoechst染料、EthD III、7-AAD或RedDot2中的一种；所述透射电镜染料为醋酸铀和柠檬酸铅。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中所述荧光蛋白为增强型绿色荧光蛋白、增强型黄色荧光蛋白、mVenus荧光蛋白中的一种。