[发明专利]一条可与头孢喹肟特异性结合的核酸适配体及其筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全与抗生素检测领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配基系统进化技术)筛选一条能与头孢喹肟特异性结合的核酸适配体及其筛选方法。为该核酸适配体在食品、药品及生物制品中头孢喹肟的监管和分析检测等方面的应用提供科学依据和理论基础。

背景技术

进入二十一世纪以来，我国的畜牧业迅速发展。近年来国家相继出台的各种惠农政策，加大了养殖业的资金和政策扶持力度。为了降低牛、猪等动物的发病率与死亡率，提高饲料利用率和改善产品的质量，抗生素在畜牧业中的使用越来越广泛。随着经济的发展，人们生活水平的提高，各种牛羊肉、奶制品、家禽、蛋等动物源性食品的消费也越来越大。因此，严格控制动物源性食品安全，对消费者的健康具有非常重要的意义。头孢喹肟属于内酰胺类抗生素，又名头孢喹咪、头孢喹诺，是目前唯一一个动物专用第4代兽用头孢菌素类抗生素。其抗菌谱广、抗菌活性强、吸收快、毒副作用小和生物利用度高，国内外已广泛批准将其应用于猪、牛呼吸道和奶牛乳房炎等细菌感染的临床治疗。然而，养殖业中滥用抗生素，经常会导致其肉制品和乳制品中含有头孢喹肟抗生素残留，经食物链被人类食用后，会导致腹泻、呕吐等肠道疾病，严重者还会导致器官衰竭甚至死亡。由于它广泛存在于日常生活的食品、药品和生物制品中，严重危害了产品质量和人民的健康安全。

目前，传统检测头孢喹肟的方法主要有微生物检测法，如纸片法、氯化三苯基四氮唑试验即TTC法、戴尔沃检测法；高效液相色谱法(HPLC)；免疫分析法等。但是这些方法检测耗时长、灵敏度低，不能满足快速灵敏的市场需求。同时，其中有些方法容易受到蛋白酶等的影响而导致结果不准确。因此发展新的检测方法十分重要。

核酸适配体是指能够与目标分子特异性、高亲和地结合的单链寡聚DNA 或RNA，一段由20-90个碱基组成。它是上世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术---体外指数富集配体系统进化(SELEX)技术得到的。作为一种新型的仿生识别分子，核酸适配体能特异性的识别并紧密结合各种靶分子。与抗体-抗原的特异性识别相似，但是与抗体-抗原相比，它具有更多的优势，如高亲和力，活性稳定、易修饰、成本低、制备简单和变性与复性可逆等特点。并且不仅限于与蛋白质的特异性结合，其靶分子范围包括药物分子、氨基酸、金属离子、各种微生物和细胞等。近年来在食品安全、食品检测和疾病治疗等方面的应用引起了广泛关注。

经过近几十年的发展，已经开发了各种各样的SELEX技术，如CE-SELEX、 Magnetic-SELEX、Capture-SELEX和Cell-SELEX等。本发明基于 Magnetic-SELEX技术，以头孢喹肟为靶分子，通过正向筛选和反向筛选过程，制备了高特异性和亲和力的头孢喹肟核酸适配体。该方法具有操作简便、筛选过程成本低的优势。所获得的核酸适配体具有稳定性强、合成方便和易于标记等特点，能用于食品和药品等多方面的分析检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更高亲和特异性、无免疫原性、能够化学合成的、分子量小且性质稳定的可用于检测头孢喹肟的核酸适配体。本发明采用Magnetic-SELEX技术，以头孢喹肟为靶分子，以氨苄青霉素为反向筛选靶标，筛选出与头孢喹肟特异性结合的核酸适配体。

上述目的通过以下技术方案实现：

1.合成以下序列所示的ssDNA文库和引物：

ssDNA文库：

5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；

上引物：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’；

下引物：5’–biotin-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’。

2SELEX技术筛选特异性核酸适配体

SELEX技术筛选全过程所用的：2×SELEX结合液终浓度组成为:20mM Tris–HCl，2mM MgCl₂，5mM KCl，1mM CaCl₂，100mM NaCl，每100ml 2×SELEX 结合液加12.5ul的Tween 20，pH 7.6.(1×SELEX结合液即把2×SELEX结合液稀释1倍)

清洗液终浓度组成为：40mM Tris–HCl，10mM EDTAS，3.5M尿素，每 100ml SELEX清洗液中加12.5ul Tween 20Ph＝7.35