[发明专利]一条可与头孢喹肟特异性结合的核酸适配体及其筛选方法

权利要求书

1.一条可与头孢喹肟特异性结合的核酸适配体，其序列为5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGTGGGCGCCGACGTACTAAACAGGGGAACCTACCTGGTTAACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。

2.筛选如权利要求1所述核酸适配体的方法，其特征在于：

(1)合成以下序列所示的随机单链DNA和引物：

ssDNA随机文库：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；

上引物：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’；

下引物：5’–biotin-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’；

(2)SELEX技术筛选特异性核酸适配体：

a.将ssDNA文库溶于250μl灭菌水中，70-95℃变性5min，然后冰浴10min，向其中加入250μl的结合缓冲液混合均匀，备用

b.制备磁珠-头孢喹肟结合的复合物，取该复合物500μl,然后加入ssDNA文库于室温条件下孵育0.5-2小时,磁分离弃掉未结合的ssDNA,用清洗液清洗3次，磁分离弃上清；

c.向磁珠中加入300μl TE溶液，沸水浴2-20min；然后磁分离，收集上清作为PCR扩增模板，作为下一轮筛选的次级库；

所用的结合缓冲液组成为:20mM Tris–HCl，2mM MgCl₂，5mM KCl，1mM CaCl₂，100mM NaCl，Tween 20，pH 7.6.

(3)PCR扩增文库：以(2)中步骤c得到的上清为模板，下游引物和上游引物进行PCR扩增；

(4)单链DNA文库的制备：取链霉亲和素磁珠用清洗液洗三遍，加入到PCR产物中，振动摇匀捕获10-50min，磁分离去上清，再清洗3遍；加入0.2mol/L的氢氧化钠溶液变性1-10min，磁分离取上清，后加入盐酸中和，纯化、冻干；用作下一轮筛选；

(5)第三轮筛选：

a.以氨苄青霉素为反筛物，把氨苄青霉素偶联在羧基磁珠上；取磁珠-氨苄青霉素复合物，用结合液清洗，然后加入ssDNA次级文库于室温条件下孵育；

b.孵育结束后，磁分离吸取未结合的ssDNA，加入到用结合液洗好的磁珠-头孢喹肟中继续孵育；

c.用缓冲液清洗，清洗完毕后磁分离弃上清，磁珠中加入300μl TE缓冲液，混合均匀，沸水浴后磁分离，吸取上清；

d.重复过程a-c，重复到5-15轮,用酶标仪测次级ssDNA文库与靶标结合能力,直到荧光强度达到最大饱和状态，此时得到头孢喹肟核酸适配体。

3.筛选如权利要求1所述核酸适配体的方法，其特征在于：

1).合成以下序列所示的随机单链DNA和引物：

ssDNA文库：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；

上游引物：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’；

下游引物：5’–biotin-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’；

2)SELEX技术筛选特异性核酸适配体

SELEX技术筛选全过程所用的：2×SELEX结合液终浓度组成为:20mM Tris–HCl，2mM MgCl₂，5mMKCl，1mM CaCl₂，100mM NaCl，每100ml 2×SELEX结合液加12.5ul的Tween 20，pH 7.6.

清洗液终浓度组成为：40mM Tris–HCl，10mM EDTAS，3.5M尿素，每100ml SELEX清洗液中加12.5ul Tween 20,pH＝7.35

TE缓冲溶液终浓度组成为：10mM Tris–HCl，1mM EDTA；

2.1 第一轮筛选步骤：

2.1.1 取2.5OD ssDNA文库溶于250μl灭菌水中，95℃反应5min，后立即冰浴10min，与250μl的2×SELEX结合液混合均匀，备用；

2.1.2 取磁珠-头孢喹肟复合物500μl，用1×SELEX结合液清洗3遍，，然后加入2.1.1中的ssDNA文库于室温条件下孵育1h；

2.1.3 孵育结束后，用清洗液清洗3遍，

清洗完毕后磁分离弃上清，向磁珠中加入300μl TE缓冲液，混合均匀，沸水浴10min；然后磁分离，吸取上清作为下一轮模板；

2.1.4 以2.1.3所得上清为模板，下游引物和上游引物进行PCR扩增；

2.2 第二轮筛选步骤

2.2.1 制备单链DNA：取80μl的链霉亲和素磁珠，用清洗液洗三遍，加入到2.1.4PCR扩增的产物中，振动摇匀捕获30min，磁分离去上清，用清洗液洗，加入50μl，0.2mol/L的氢氧化钠溶液反应5min，磁分离取上清，后加入0.2mol/L的稀盐酸用广泛PH试纸调至7，纯化、冻干；该次级ssDNA文库用作下一轮筛选；

2.2.2 取2.2.1筛选得到的次级ssDNA文库溶于250μl灭菌水中，于95℃反应5min，后立即冰浴10min，与250μl的2×SELEX结合液混合均匀，备用；

2.2.3 取磁珠-头孢喹肟复合物500μl，用1×SELEX结合液清洗，然后加入2.2.2中的ssDNA文库于室温条件下孵育1h；

2.2.4 孵育结束后，用清洗液清洗3遍，

清洗完毕后磁分离弃上清，向磁珠中加入300μl TE缓冲液，混合均匀，沸水浴10min；然后磁分离，吸取上清作为下一轮模板；

2.2.5 以2.2.4所得上清为模板，下游引物和上游引物进行PCR扩增；

2.3 第三轮扩增步骤

2.3.1 制备单链DNA：取80μl的链霉亲和素磁珠，用清洗液洗后加入到2.2.5PCR扩增的产物中，振动摇匀捕获30min，磁分离去上清，用清洗液洗三遍，加入50μl，0.2mol/L的氢氧化钠溶液反应5min，磁分离取上清，后加入0.2mol/L的用广泛pH试纸调至7，纯化、冻干；该次级ssDNA文库用作下一轮筛选；

2.3.2 取2.3.1筛选得到的次级ssDNA文库溶于250μl灭菌水中，于95℃反应5min，后立即冰浴10min，与250μl的2×SELEX结合液混合均匀，备用；

2.3.3 取磁珠-反筛物氨苄青霉素复合物500μl，用1×SELEX结合液清洗，然后加入2.3.2制备的ssDNA次级文库于室温条件下孵育30min；磁分离吸取上清，用于下一步的正筛反应；

2.3.4 正筛过程为：取2.3.3的上清液，加入到500ul磁珠-头孢喹肟结合的复合物中，孵育时间60min；

2.3.5 孵育结束后，磁分离弃上清，用清洗液清洗3次，每次用量500ul，清洗时间1min；清洗完毕后磁分离弃上清，磁珠中加入300μl TE缓冲液，混合均匀，沸水浴10min；然后磁分离，吸取上清；以此上清作为下一轮模板

2.3.6 以2.3.5所得上清为模板，下游引物和上游引物进行PCR扩增；

2.4 第四轮扩增步骤

2.4.1 制备单链DNA：取80μl的链霉亲和素磁珠，用清洗液洗后加入到2.3.6PCR扩增的产物中，振动摇匀捕获30min，磁分离去上清，用清洗液洗后加入50μl，0.2mol/L的氢氧化钠溶液反应5min，磁分离取上清，后加入0.2mol/L的稀盐酸用广泛PH试纸调至7，纯化、冻干；该次级ssDNA文库用作下一轮筛选；

2.4.2 取2.4.1筛选得到的次级ssDNA文库溶于250μl灭菌水中，于95℃反应5min，后立即冰浴10min，与250μl的2×SELEX结合液混合均匀，备用；

2.4.3 取磁珠-反筛物氨苄青霉素复合物500μl，用1×SELEX结合液清洗，然后加入2.4.2制备的ssDNA次级文库于室温条件下孵育40min；磁分离吸取上清，用于下一步的正筛反应；

2.4.4 正筛过程为：取2.4.3的上清液，加入到400ul磁珠-头孢喹肟结合的复合物中，孵育时间50min；

2.4.5 孵育结束后，磁分离弃上清，用清洗液清洗4次，每次用量600ul，清洗时间2min；清洗完毕后磁分离弃上清，磁珠中加入300μl TE缓冲液，混合均匀，沸水浴10min；然后磁分离，吸取上清；以此上清作为下一轮模板；

2.4.6 以2.4.5所得上清为模板，下游引物和上游引物进行PCR扩增；

2.5 第五轮扩增步骤

2.5.1 制备单链DNA：取80μl的链霉亲和素磁珠，用清洗液洗后加入到2.4.6PCR扩增的产物中，振动摇匀捕获30min，磁分离去上清，用清洗液洗后加入50μl，0.2mol/L的氢氧化钠溶液反应5min，磁分离取上清，后加入0.2mol/L的稀盐酸用广泛pH试纸调至7，纯化、冻干；该次级ssDNA文库用作下一轮筛选；

2.5.2 取2.5.1筛选得到的次级ssDNA文库溶于250μl灭菌水中，于95℃反应5min，后立即冰浴10min，与250μl的2×SELEX结合液混合均匀，备用；

2.5.3 取磁珠-反筛物氨苄青霉素复合物500μl，用1×SELEX结合液清洗后加入2.5.2制备的ssDNA次级文库于室温条件下孵育50min；磁分离吸取上清，用于下一步的正筛反应；

2.5.4 正筛过程为：取2.5.3的上清液，加入到300ul磁珠-头孢喹肟结合的复合物中，孵育时间40min；

2.5.5 孵育结束后，磁分离弃上清，用清洗液清洗5次，每次用量700ul，清洗时间3min；清洗完毕后磁分离弃上清，磁珠中加入300μl TE缓冲液，混合均匀，沸水浴10min；然后磁分离，吸取上清；以此上清作为下一轮模板

2.5.6 以2.5.5所得上清为模板，下游引物和上游引物进行PCR扩增；

2.6 第六轮扩增步骤

2.6.1 制备单链DNA：取80μl的链霉亲和素磁珠，用清洗液洗后加入到2.5.6PCR扩增的产物中，振动摇匀捕获30min，磁分离去上清，用清洗液洗三遍后加入50μl，0.2mol/L的氢氧化钠溶液反应5min，磁分离取上清，后加入0.2mol/L的稀盐酸用广泛pH试纸调至7，纯化、冻干；该次级ssDNA文库用作下一轮筛选；

2.6.2 取2.6.1筛选得到的次级ssDNA文库溶于250μl灭菌水中，于95℃反应5min，后立即冰浴10min，与250μl的2×SELEX结合液混合均匀，备用；

2.6.3 取磁珠-反筛物氨苄青霉素复合物500μl，用1×SELEX结合液清洗后加入2.6.2制备的ssDNA次级文库于室温条件下孵育60min；磁分离吸取上清，用于下一步的正筛反应；

2.6.4 正筛过程为：取2.6.3的上清液，加入到200ul磁珠-头孢喹肟结合的复合物中，孵育时间30min；

2.6.5 孵育结束后，磁分离弃上清，用清洗液清洗6次，每次用量800ul，清洗时间4min；清洗完毕后磁分离弃上清，磁珠中加入300μl TE缓冲液，混合均匀，沸水浴10min；然后磁分离，吸取上清；以此上清作为下一轮模板

2.6.6 以2.6.5所得上清为模板，下游引物和上游引物进行PCR扩增；

3).获得头孢喹肟核酸适配体：每轮筛选所得到的次级ssDNA文库通过5’端标记荧光基团与靶标结合后，用酶标仪测次级ssDNA文库与靶标结合能力；直到荧光强度达到最大饱和状态，此时得到头孢喹肟核酸适配体。