[发明专利]一种证明核转染小干扰RNA安全性的方法

说明书

本发明提供了一种证明核转染小干扰RNA安全性的方法，包括如下步骤：分离得到骨髓单个核细胞；将所述骨髓单个核细胞通过加入针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA进行核转染，得到转染细胞悬液；利用甲基纤维素半固体培养法分析小干扰RNA作用后对健康人骨髓单个核细胞体外分化和增值能力的影响，以证明转染小干扰RNA安全性。本发明所提供的证明核转染小干扰RNA安全性的方法，操作方法原理简单，周期短，避免了现有技术中尚没有方法能够证明现有的载体系统的安全性，即为是否可以高效、安全地向人体内转移siRNA片段，使之发挥预期抑癌作用，转移载体是否会诱发癌变等问题。

技术领域

本发明涉及基因工程的技术领域，具体而言，涉及一种证明核转染小干扰RNA安全性方法。

背景技术

肿瘤治疗基因药物是近10年来国内外研究的重点之一，主要包括反义核酸和siRNA。根据肿瘤细胞所表达的特异基因或高表达肿瘤相关基因，设计相应的反义核酸或通过RNA干扰技术筛选有效的特异干扰性小分子RNA(small interfering RNA,siRNA)。这些siRNA可靶向结合目的基因mRNA，从而下调相关基因的表达，达到抗肿瘤效果。RNA干扰现象(RNAi)最早是在20世纪90年代初观察到的，1995年和1998年分别由美国康乃尔大学的华人博士Guo等和华盛顿卡耐基研究院的Fire A等正式提出RNAi的概念。RNAi是在mRNA水平上由外源性或内源性双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的高度特异的基因沉默过程。

RNAi技术是将双链RNA(dsRNA)切割成21-23个核苷酸的siRNA，人为转染至靶细胞后，与细胞内的内切酶形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)，RISC特异性结合mRNA同源区，以siRNA为模板，特异地识别其同源性靶mRNA分子并对其进行递进式剪切,形成强有效的瀑布效应,诱导序列特异性的mRNA降解,从而沉默了目的基因的表达。此外，siRNA还可以使mRNA相对应的DNA甲基化，这一过程扩大了原有的甲基化，从而进一步增强基因沉默效应，即所谓转录水平基因沉寂。

研究表明，RNAi技术具有：(1)特异性：dsRNA只对同源基因的表达产生抑制作用，无关基因不受影响；(2)高效性：少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体的程度，实现相应基因的表达抑制；(3)ATP依赖性：在Dicer酶将dsRNA切割成siRNA过程及RISC过程均需要ATP的参与；(4)时间浓度依赖性：RNAi作用在一定范围内与dsRNA的浓度呈正比；(5)遗传保守性：靶基因转录后沉默(Posttranscriptional gene silencing，PTGS)现象在低等多细胞动物和植物中出现时可以扩增、复制、并在细胞之间相互传递，在不同细胞甚至生物体间长距离的传递和维持；(6)完全抑制效应：发生过程中存在正反馈的信号放大效应。

由于RNAi作用能特异地沉默与疾病有关的外源性或内源基因，使疾病相关蛋白的mRNA发生特异性的降解，降解外源RNA病毒、逆转录病毒基因组，且作用的高效性和高特异性的特点，使RNAi成为肿瘤治疗领域中的新希望。

Ming等首次利用RNAi技术来抑制体外培养的宫颈癌细胞HPVE6、E7蛋白，发现被siRNA干扰的E7蛋白的mRNA水平降低了50％-60％，E6蛋白的mRNA水平降低了70％。已有研究将survivin(生存素)基因特异siRNA导入胰腺癌细胞，生存素mRNA的表达下调90％，从而抑制胰腺癌细胞的生长。Aloy等通过siRNA干扰降低热休克蛋白27的合成，对鼻咽癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤对放疗的敏感性有显著提高。