[发明专利]一种证明核转染小干扰RNA安全性的方法

权利要求书

1.一种证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，分离得到骨髓单个核细胞；

S2，将所述骨髓单个核细胞通过加入针对目的基因设计的小干扰RNA和对照RNA进行核转染，得到转染细胞悬液；

S3，利用甲基纤维素半固体培养法分析小干扰RNA作用后对健康人骨髓单个核细胞体外分化和增值能力的影响，以证明转染小干扰RNA安全性。

2.如权利要求1所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S3，包括：

S31，在培养板中设立证明红细胞集落形成能力的BFU-E组、证明粒细胞巨噬细胞集落形成能力的CFU-GM组和证明巨核细胞集落形成能力的CFU-Meg组，在各组中均加入胎牛血清、干细胞因子、SCF、IL-3、RPMI1640培养基、甲基纤维素溶液和所述转染细胞悬液，并分别在BFU-E组中加入EPO，在CFU-GM组中加入GM-CSF，在CFU-Meg组中加入TPO，分别混匀并培养14天；

S32，在显微镜下计数CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组的细胞集落数。

3.如权利要求2所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S31，包括：

S311，在培养板中，设立CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组，每组3孔，其内容物及添加顺序如下：

BFU-E组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度30IU/mL的EPO、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；

CFU-GM组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度10μg/mL的GM-CSF、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；

CFU-Meg组：依次加入75μL的终体积百分数15％的新生牛血清、50μL的终浓度30ng/mL的SCF、50μL的终浓度100IU/mL的IL-3、50μL的终浓度50μg/mL的TPO、100μL的RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素溶液；

S312，将CFU-GM组、BFU-E组和CFU-Meg组的内容物进行混匀，并在每孔均加入50μL的所述转染细胞悬液，置于37℃、饱和湿度、5％CO2下培养14天。

4.如权利要求2所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S32，包括：

在显微镜下分别计数各组的细胞集落数；其中，

所述CFU-GM组为大于40个细胞记为1个细胞集落；

所述BFU-E组为大于50个细胞记为1个细胞集落；

所述CFU-Meg组大于3个细胞记为1个细胞集落。

5.如权利要求1所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S1，包括：

S11，取淋巴细胞分离液3-4mL加入离心管内，将稀释后的骨髓抗凝血标本混悬液置于所述淋巴细胞分离液上，离心分离；

S12，吸取中间层，再加入PBS吹打，离心弃上清，加入PBS至2mL，混匀，取其中0.02mL加入至含0.38mL的白细胞稀释液中，混匀并计数。

6.如权利要求5所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述步骤S12中PBS的浓度为10mm。

7.如权利与要求5所述证明核转染小干扰RNA安全性的方法，其特征在于，所述白细胞稀释液为2％冰醋酸。