[发明专利]一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1，菌种库的建立

百日咳菌种库的建立：将百日咳菌种接种于包-姜氏培养基上，于35～37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，传至第4代，培养24小时，刮下菌苔，于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；

白喉棒状杆菌菌种库的建立：将白喉棒状杆菌菌种接种于林氏培养基上，于34℃培养24～48小时，再传代于林氏培养基上，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；

破伤风芽孢杆菌菌种库的建立：将破伤风厌氧芽孢杆菌菌株接种于半固体碎肉培养基中管，放置于34℃孵箱内培养48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；

B型嗜血流感杆菌菌种库的建立：将B型嗜血流感杆菌菌种接种于PH7.4的包-姜氏培养基上，于35～37℃培养24～48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，为主代种子批菌种；

S2，百日咳原液的制备

硫酸铵盐析：将百日咳主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入硫酸铵溶液进行一次盐析、7日后经3500rPm离心40分钟，弃上清，沉淀中加入PBS进行一次浸提，每天搅拌2次，每次40分钟；经7000rPm离心60分钟弃沉淀、上清液中加高浓度的硫酸铵二次盐析、经9000rPm离心60分钟，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天搅拌2次，每次1小时，包袋透析，铵根检测合格后，透析内液经16000rPm离心3小时收上清；

密度梯度离心：经30000rpm蔗糖密度梯度离心18～20小时除去内毒素，收集糖浓度为4％～12％之间的样品，其中含有PT和FHA组分；

戊二醛脱毒：将梯度离心后的中间品用PBS稀释为50μgPN/ml，然后加入戊二醛使之最终戊二醛浓度为0.5％，置于20℃脱毒，每1小时振摇一次，然后加入赖氨酸溶液，使之最终浓度为0.2％，置于20℃作用3小时；

S3，白喉类毒素制备

将白喉棒状杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，在37～39℃下脱毒42天；

S4，破伤风类毒素制备

将破伤风厌氧芽孢杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛，加入的甲醛量为0.15％，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；

S4，B型嗜血流感毒素制备

将B型嗜血流感杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；

S5，四价联合疫苗的配置

将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素、水油乳剂MF59和PLG微粒混合配置成百白破疫苗，再将B型嗜血流感毒素与百白破疫苗混合制得四价联合疫苗。