[发明专利]一种检测活细胞内Paxillin蛋白力传递的荧光生物探针

说明书

本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，具体涉及一种检测活细胞内Paxillin蛋白力传递的荧光生物探针，是一种基于FRET技术的生物探针，它能够动态地检测活细胞内Paxillin蛋白力传递的变化。该探针包括FRET荧光蛋白对ECFP与YPet、弹性序列Linker、Ld12序列以及Lim1234序列五个部分。该探针与pcDNA3.1(+)的重组质粒转染入活细胞后，可以在细胞中自发表达出荧光蛋白重构融合探针，自动整合到Paxillin蛋白所在的局部黏着斑区域，定性地检测活细胞内Paxillin蛋白力传递的变化，且对细胞没有毒副作用。

技术领域

本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，具体涉及一种检测活细胞内Paxillin蛋白力传递的荧光生物探针，是基于荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer，FRET)技术和常规生物工程亚克隆技术设计制备的生物探针。它的探针结构能够在活细胞内自行表达，通过荧光信号的变化定性地反映活细胞内Paxillin蛋白力传递的变化。

背景技术

细胞受到外力作用后的异常反应与某些疾病相关。外界力作用于活细胞的细胞膜，然后经过跟细胞膜连接的细胞骨架蛋白等结构在细胞内进行物理传递。Paxillin蛋白是细胞内局部黏着斑上的重要结构蛋白，其对力的传递与细胞局部黏着斑的动态变化直接相关。目前还没有可以一种可以实现对活细胞内Paxillin蛋白上力传递进行检测的有效方法。鉴于此，本发明提出一种基于FRET技术、运用于检测活细胞内Paxillin蛋白力传递的荧光生物探针，它的优点是对细胞没有毒害、实现动态检测、时间分辨率高、成本低等。

发明内容

本发明提供一种可检测活细胞内Paxillin蛋白力传递的新型荧光生物探针，设计中将FRET技术与常规生物工程亚克隆技术结合，具体技术方案如下：

一种检测活细胞内Paxillin蛋白力传递的荧光生物探针，该探针包括FRET荧光蛋白对ECFP(1-2)与YPet(1-4)、弹性序列Linker(1-3)、Paxillin蛋白的结构域Ld12序列(1-1)以及Paxillin蛋白的另一个结构域Lim1234序列(1-5)五个部分，运用亚克隆技术对这五个部分的DNA序列进行剪切和拼接重构，并与pcDNA3.1(+)形成重组质粒。

其中，Ld12氨基酸序列为：

DLDALLADLESTTELDRLLLELNAVQ

其对应的DNA序列为：

GCGGCCGCCACCATGGGCTGCATCAAGAGCAAGCGCAAGGACAACCTGAACGACGACGGCGTGGACATGAAGACC

Lim1234氨基酸序列为：

CGACKKPIAGQVVTAMGKTWHPEHFVCTHCQEEIGSRNFFERDGQPYCEKDYHCYYCNGPILDKVVTALDRTWHPEHFFCAQCGAFFGPEGFHEKDGKAYCRKDYCGGCARAILENYISALNTLWHPECFVCRECFTPFVNGSFFEHDGQPYCEVHYHCSGCQKPITGRCITAMAKKFHPEHFVCAFCLKQLNKGTFKEQNDKPYCQNCF

对应的DNA序列为：