[发明专利]MDCK细胞宿主残留蛋白的制备及其用途

说明书

本发明涉及一种MDCK细胞宿主残留蛋白的制备及其用途，所述蛋白的制备方法包括如下步骤，(1)收集稳定培养的MDCK细胞的培养液；(2)对所述培养液进行微滤，收集滤出液；(3)对所述的滤出液进行超滤浓缩，得浓缩液；(4)对所述浓缩液进行分子筛凝胶层析纯化，得纯化液；(5)对所述纯化液进行再次浓缩，得所述稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白(MDCK细胞宿主残留蛋白)溶液。所述的用途包括但不限于使用所述蛋白制备抗体或试剂盒，用于评价疫苗质量。

技术领域

本发明属于疫苗制剂领域，具体而言，涉及一种MDCK细胞宿主残留蛋白的制备及其用途。

背景技术

MDCK((Madin-Daby canine kidney cells)，由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬的肾脏组织分离培育建立，通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)被公认为最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的3种细胞系之一。

残留在生物制品中的宿主细胞蛋白(host cell protein，HCP)属于异源蛋白，既包括宿主细胞的结构蛋白液也包括宿主细胞(传代细胞)分泌的促生长因子。HCP不仅有可能诱导机体产生抗HCP抗体，引起机体产生过敏反应，还有可能有“佐剂效应”而引起机体对蛋白质药物产生抗体，影响药物治疗效果。因此控制疫苗中HCP含量是保证疫苗质量的一项重要内容。1998年，WHO制定了《使用动物细胞生产生物制品规程》，其中对传代细胞的HCP残留量提出了指导性要求，即将传代细胞HCP含量降低至可接受水平。目前，大部分疫苗只是通过控制疫苗的总蛋白含量进行间接控制。

韩国学者Kim HyunSu等首先报导了检测Vero细胞制备的乙型脑炎减毒活疫苗中HCP残留含量方法，日本学者Keishin Sugawara等使用酶联间接双抗体夹心法检测Veto细胞生产的乙型脑炎灭活疫苗中HCP含量，田博等报导建立间接酶联免疫法，但重复性差敏感度低，王辉等报导建立了酶联双抗体夹心法检测Vero细胞残留蛋白含量。

王辉等建立的酶联双抗体夹心法检测Vero细胞残留蛋白含量的方法是最接近本发明的技术方案。步骤主要包括：备Veto细胞蛋白抗原参考品，免疫家兔，提纯抗体作为包被抗体并以酶标记，建立酶联免疫检测系统。用Vero细胞蛋白抗原参考品绘制定量标准曲线，并对各项指标进行验证。

MDCK细胞作为细胞基质主要被用作流感疫苗的研制，但目前国际上尚无用MDCK制备的流感疫苗上市，更无特异性MDCK细胞宿主蛋白(HCP)的检测手段。市面上也没有出售用于检测MDCK细胞HCP残余量的试剂盒，主要原因是MDCK细胞工艺特异蛋白以及针对该蛋白的特异性抗体难以制备。本发明所要解决的问题在于提供检测MDCK细胞HCP的抗原标准品和抗体，同时建立起相应的检测方法，以备在疫苗生产和质控中检测MDCK细胞HCP残余量。

发明内容

本发明首先涉及一种稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白(即为MDCK细胞宿主残留蛋白)的制备方法，所述方法包括如下步骤，

(1)收集稳定培养的MDCK细胞的培养液；

(2)对所述培养液进行微滤，收集滤出液；

(3)对所述的滤出液进行超滤浓缩，得浓缩液；

(4)对所述浓缩液进行分子筛凝胶层析纯化，得纯化液；

(5)对所述纯化液进行再次浓缩，得所述稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白溶液。

所述的稳定培养MDCK细胞的方法包括：

(1)以3×10⁵个/cm²接种细胞至反应器中，进行培养；

(2)细胞经对数生长期逐渐进入平台期后，换成不含血清的新鲜培养基，继续培养；