[发明专利]MDCK细胞宿主残留蛋白的制备及其用途

权利要求书

1.一种稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白的检测抗体的制备方法，所述方法包括如下步骤，

(1)收集稳定培养的MDCK细胞的培养液；

(2)对所述培养液进行微滤，收集滤出液；

(3)对所述的滤出液进行超滤浓缩，得浓缩液；

(4)对所述浓缩液进行分子筛凝胶层析纯化，得纯化液；

(5)对所述纯化液进行再次浓缩，得所述稳定培养的MDCK细胞的工艺特异蛋白溶液；

(6)使用所述蛋白皮下注射免疫动物，所述动物为家兔或豚鼠；所述蛋白用量为0.3～0.4mg/kg，免疫佐剂为弗氏佐剂，佐剂用量与蛋白溶液为1：1(v/v)；

(7)免疫双向扩散测定血清效价达到≥1：32后，处死动物并取全血；

(8)选择效价较高的抗血清进行纯化，得到抗MDCK细胞蛋白IgG；

其中：

步骤(2)所述的对培养液进行微滤的方法为：

选用0.8+0.65u、0.45+0.2u的两级5英寸柱式滤芯构成微滤系统，对细胞培养液上清进行微滤，收集滤出液；

步骤(3)所述的超滤浓缩的方法为：选择MWCO＝100KD的膜包对滤出液进行超滤浓缩，其步骤为：

1)先以小于0.3MPa的透膜压力将微滤滤出液浓缩至原体积的1/10；

2)以超滤液的8～10体积的pH7.4，0.01M的PBS充分透洗，

3)将超滤液浓缩至原体积的1/60～1/80；

步骤(4)所述的分子筛凝胶层析纯化的方法为：

采用Sepharose分子筛凝胶进行层析纯化，平衡缓冲液和洗脱缓冲液均选用0.01M，pH7.4的PBS，线性流速为50cm/h，目标洗脱峰为第一洗脱峰，收集280nm波长吸收峰≥20mAU部分洗脱液；

步骤(8)所述的选择效价较高的抗血清进行纯化，得到抗MDCK细胞蛋白IgG的步骤为：

1)辛酸-硫酸铵法粗提纯抗血清；

2)用市售预装Protein-A亲和层析柱进行亲和层析，收集洗脱峰≥30mAU的洗脱液部分，合并洗脱液并用MWCO＝10KD的超滤浓缩离心管浓缩洗脱液成原体积的1/10，同时更换缓冲体系为0.01M，pH7.4的PBS，得到抗MDCK细胞蛋白的IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的稳定培养MDCK细胞的方法包括：

(1)以3×10⁵个/cm²接种细胞至反应器中，进行培养；

(2)细胞经对数生长期逐渐进入平台期后，换成不含血清的新鲜培养基，继续培养；

(3)继续培养2～4天，此时细胞为稳定培养的MDCK细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的再次浓缩的步骤为：将纯化液用MWCO＝100KD的超滤离心管浓缩至原体积的1/2～1/3，再次浓缩方法与所述超滤浓缩方法相同。

4.权利要求1至3任一所述的方法在制备检测试剂盒中的应用。