[发明专利]一种直接应用的间充质干细胞冻存液及其制备方法

说明书

本发明提供一种直接应用的间充质干细胞冻存液及其制备方法，该冻存液主要由生理盐水、羟乙基‑β‑环糊精、聚乙二醇微球和甘油按照一定的重量份组成，该冻存液本将DMSO替换成生理盐水，克服了DMSO超过用量范围后可能存在的风险问题，并且在生理盐水内加入羟乙基‑β‑环糊精、聚乙二醇微球和甘油的混合物制成的冻存液可显著提高该冻存液对间充质干细胞冻存的时间，长期保存细胞的活力，并且该冻存液不用经过洗涤可直接应用于人体。

技术领域

本发明属于干细胞冻存技术领域，特别涉及一种直接应用的间充质干细胞冻存液及其制备方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞。间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、体外扩增简单迅速、扩增培养后分化能力不变等优点，在临床疾病的治疗中具有广阔的应用前景。其应用途径有静脉输注、局部注射等方式，静脉输注这种方式因其操作简单、调节全身免疫状态效果好等优点成为比较常用的方法，临床应用间充质干细胞的一个疗程通常需要多次输注间充质干细胞，每次输注相隔一定时间，一个疗程大约1-2个月完成。所以间充质干细胞的保存，并且复苏后的活率是该间充质干细胞应用最关键的瓶颈。

现有冻存液技术是将胎牛血清、细胞培养基及DMSO(二甲基亚砜)按照一定比例混合成冻存液来存储间充质干细胞。DMSO具有一定的副作用，因此临床应用通常控制在5％-10％浓度范围内；冻存液中的胎牛血清及细胞培养基需要在间充质干细胞应用前经过反复洗涤去除，才能够进行静脉注射，并且长期接触胎牛血清有可能引起细胞某些蛋白表达及特性的变化，细胞回输人体后有可能引起过敏反应。另外一种间充质干细胞冻存液中虽然不含有胎牛血清，而是以细胞培养基、人白蛋白及DMSO配制成间充质干细胞冻存液，但是其复苏后细胞活率低，无法长时间保存细胞，因此不能满足临床应用1个疗程的时间要求。另外还有一种由DMSO、人AB血浆、勃脉力A注射液组成的间充质干细胞冻存液，其虽然不含培养基和牛血清等，可以直接应用与人体，但是该冻存液冻存的细胞活力仍很低，并且人AB血浆可能出现人体不耐受的情况，进而产生副作用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种直接应用的间充质干细胞冻存液及其制备方法，该冻存液可以长期保存间充质干细胞，并且可长期保存细胞活力，并且所使用的成分不需要经过洗涤，直接用于人体。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供一种直接应用的间充质干细胞冻存液，该冻存液主要由下列重量份数的组分组成：

进一步的改进，所述聚乙二醇微球是由如下重量份数成分制备而成：

聚乙二醇400 2.8-3.5

壳聚糖 0.5-1.2。

本发明提供的直接应用的间充质干细胞冻存液，将DMSO替换成生理盐水，克服了DMSO超过用量范围后可能存在的风险问题，并且在生理盐水内加入淀粉甘醇酸钠、聚乙二醇微球和甘油的混合物制成的冻存液可显著提高该冻存液对间充质干细胞冻存的时间，长期保存细胞的活力，并且该冻存液不用经过洗涤可直接应用于人体。

进一步的改进，所述聚乙二醇微球是通过如下方法制备得到的：配置浓度为15.4g/mL的壳聚糖水溶液；将聚乙二醇400加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将壳聚糖水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，然后加入交联剂，室温搅拌发生交联反应1-2h，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得聚乙二醇微球。

进一步的改进，所述冻存液中还包括重量份数为2-3份的吐温80和0.5-1份的月桂酰谷氨酸钠。