[发明专利]一种泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的制备和使用方法

说明书

本发明公开了一种泥鳅凡隆气单胞菌疫苗，包括以下原料：凡隆气单胞菌、泥鳅(体重在14‑21g之间)、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、15g琼脂粉(液体不加)、蒸馏水1000mL、甲醛、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶试剂盒。本发明通过多次试验论证以及采用了大量的试验数据计算，并且依据长时间的科学记载和推断，最终得出该泥鳅凡隆气单胞菌疫苗在对于提高泥鳅的免疫保护中，起到了显著地效果，在对该泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的试验中，多次采用了对照试验的方式，得出了显著的试验对比效果，为实验提供了有效的说服力，解决了现有国内凡隆气单胞菌疫苗的研究困难，填补了现今尚未有凡隆气单胞菌疫苗对泥鳅免疫保护的研究的空白。

技术领域

本发明涉及泥鳅疫苗技术领域，具体为一种泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的制备和使用方法。

背景技术

我国水产养殖业发展迅速，养殖种类丰富多样。泥鳅是我国水产养殖的主要种类之一，但由于养殖集约化程度的增强，泥鳅疾病频发，因此抗生素大量使用，使细菌产生一定的耐药性，产品也存在抗生素残留的风险。相比之下，使用疫苗来抑制鱼类疾病具有毒副作用小、药物残留少、大大增强机体免疫力及无耐药性产生等优点而更具安全性。

在我国，水产疫苗的研制及应用，起步较晚且发展缓慢，极不符合我国世界第一水产养殖大国之称，更与建成水产养殖强国的前景相距甚远。同时，国内对凡隆气单胞菌的研究，大部分仍处在分离及生理生化鉴定阶段，凡隆气单胞菌疫苗的研制及免疫学研究在国内鲜有报道，仅李正伟制备的灭活疫苗对鲫鱼和草鱼有较好的免疫保护性，陈亨利等制备的灭活疫苗能诱导锦鲤机体产生较好的免疫应答及简灯通过提取灭活疫苗的外膜蛋白，添加铝佐剂制成不同疫苗来研究对草鱼的免疫效果。因此，本实验通过制备凡隆气单胞菌疫苗对泥鳅进行免疫接种并对其免疫效果进行初步研究，探讨其灭活疫苗是否能对泥鳅产生一定的免疫保护效应，为凡隆气单胞菌灭活疫苗在水产动物上的应用提供参考。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的制备和使用方法，解决了现有国内凡隆气单胞菌疫苗处于研发瓶颈阶段以及尚未有凡隆气单胞菌疫苗对泥鳅免疫保护的研究的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种泥鳅凡隆气单胞菌疫苗，包括以下原料：凡隆气单胞菌、泥鳅(体重在14-21g之间)、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、15g琼脂粉(液体不加)、蒸馏水1000mL、甲醛、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶试剂盒。

优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的制备，包括以下步骤：

S1)制备LB液体培养基：将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、15g琼脂粉(液体不加)、蒸馏水1000mL倒进实验用烧杯，搅拌溶解，调节pH至7.4，再经121℃高压灭菌，常温保存；

S2)凡隆气单胞菌菌株的复壮：用移液枪准确吸取0.2mL实验室(-70℃)保存的凡隆气单胞菌，加入LB液体培养基中，在28℃振荡培养箱中振摇12小时后，将复苏的凡隆气单胞菌通过接种环于LB液体培养基上以三区划线的方式进行菌落平板划线，在28℃生化培养箱培养15小时后，保存于4℃冰箱中备用；

S3)疫苗的制备：用接种环挑取单个菌落，接种培养于LB液体培养基，28℃振荡培养箱培养12小时，通过平板计数法计算菌液浓度，将菌液浓度调整至109CFU/mL，使用终浓度为0.2％的甲醛溶液在28℃条件下以及恒温灭活24小时的方式制得疫苗，置于4℃的冰箱中保存备用。

优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对S2中复壮的凡隆气单胞菌菌株菌落形态特征及革兰氏染色观察如下：将已复壮的凡隆气单胞菌菌株进行平板划线，于28℃生化培养箱培养24小时后，观察其菌落形态，并进行革兰氏染色观察。