[发明专利]一种基于超高效液相色谱检测筛选高产麦角固醇红曲菌的方法

说明书

本发明公开了一种基于超高效液相色谱检测筛选高产麦角固醇红曲菌的方法，所述色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm，1.7um)；流动相：乙睛：水＝95：5；流速：0.3ml/min；检测器：紫外可见光检测器；检测波长：282nm；运行时间：10min；进样体积2μL。本发明首次采用UPLC方法检测出红曲菌发酵产物中的麦角固醇含量，所采用的色谱条件和样品处理方法能排除大部分杂质的干扰，制得的图谱具有分离度高、峰形对称、基线平稳、出峰时间短等优点，检测出的含量具有较高的灵敏度和准确性，能够在较短的时间内筛选出高产麦角固醇的菌株。

技术领域

本发明属于工程微生物领域，涉及红曲菌的筛选方法，尤其是一种基于超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)检测筛选高产麦角固醇红曲菌的方法。

背景技术

麦角固醇是重要的脂溶性维生素D₂源，可防治婴幼儿维生素D缺乏性佝偻症，对促进孕妇和老年人钙、磷的吸收有明显的生理作用。同时由于其作为甾族化合物的结构特点，一直被用作可的松、黄体酮等甾体激素类药物的重要生产原料。国内外主要采用微生物发酵法生产麦角固醇，应用的菌种主要有酵母菌、红曲菌、青霉和黑曲霉等，其中以酵母菌的含量最高，但部分高产麦角固醇红曲菌含量接近工业生产的酵母水平。

红曲菌用作酿酒和天然色素在我国已有悠久历史，自古以来，国内外对于红曲的研究集中在天然色素方面，而对于其生物活性物质的研究较少，直至1979年，日本学者Endo教授发现了红曲霉中的胆固醇合成抑制剂Monacolin K，激起了科学界对红曲的功能性、药用价值、作用机理等多方面的深入研究。1962年李钟庆和陈松生发现红曲菌菌丝体含大量麦角固醇，且不同种含量差异很大。目前麦角固醇的测定多采用紫外分光光度法或HPLC法，随着分析检测技术的发展，建立更准确、便捷的红曲菌发酵产品麦角固醇的测定方法有着极为重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供所述的一种基于UPLC检测筛选高产麦角固醇红曲菌的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

(1)标准曲线的制备：称取100mg麦角固醇标准品用无水乙醇溶解并定容至100mL，作标准储备液，用标准储备液分别配制1，5，10，40，80，100，200，400，800mg/L九份标准液，在色谱条件下进样，以峰面积对标准液浓度做回归曲线，得到回归方程；

(2)样品检测：称取红曲菌发酵样品，经预处理后，在色谱条件下进样，根据得到的峰面积计算浓度，

所述色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm，1.7um)；流动相：乙睛：水＝95：5；流速：0.3ml/min；检测器：紫外可见光检测器；检测波长：282nm；运行时间：10min；进样体积2μL。

优选地，所述样品预处理方法是：精密称取烘干粉碎的红曲菌发酵样品0.50g于圆底烧瓶中，加入16mL 25％氢氧化钠-乙醇水溶液，85℃皂化1.5h，补加4mL无水乙醇继续皂化1h，冷却至室温加10mL乙醚，振荡30s，静置萃取30min，重复2次；取上层萃取液水洗至中性，将乙醚全部蒸干，用无水乙醇定容至25mL，样品经0.22μm尼龙膜过滤。

所述25％氢氧化钠-乙醇水溶液，是将25g氢氧化钠溶于40mL去离子水后，用无水乙醇定容至100mL。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明首次采用UPLC方法检测出红曲菌发酵产物中的麦角固醇含量，所采用的色谱条件和样品处理方法能排除大部分杂质的干扰，制得的图谱具有分离度高、峰形对称、基线平稳、出峰时间短等优点，检测出的含量具有较高的灵敏度和准确性。