[发明专利]一种2型糖尿病脾虚证唾液蛋白标记物的检测方法

权利要求书

1.一种2型糖尿病脾虚证唾液蛋白标记物的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于-80℃；

(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；

(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；

(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；

(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；

(6)ABI-5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；

(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI-5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析；

(8)检测结果：对糖尿病脾虚证和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，糖尿病脾虚证中鉴定到的1.5倍以上表达差异的显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个；差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：

1)检索号为Q07654，基因注释为Trefoil factor 3；

2)检索号为B7WNR0，基因注释为Serum albumin；

3)检索号为G3V1N2，基因注释为HCG1745306,isoform CRA_a；

4)检索号为E5RG43，基因注释为Carbonic anhydrase 1(Fragment)；

5)检索号为Q13748，基因注释为Tubulin alpha-3C/D chain；

6)检索号为I3L2A8，基因注释为Tigger transposable element-derived protein 7(Fragment)；

7)检索号为P19367，基因注释为Hexokinase-1；

8)检索号为Q9Y3I0，基因注释为tRNA-splicing ligase RtcB homolog；

9)检索号为P27169，基因注释为Serum paraoxonase/arylesterase 1；

10)检索号为A0A087X232，基因注释为Complement C1s subcomponent ；

11)检索号为Q8IYW2，基因注释为Cilia-and flagella-associated protein 46；

12)检索号为A0A0A0MS98，基因注释为Band 3anion transport protein；

13)检索号为H0YEY4，基因注释为ADP-sugar pyrophosphatase(Fragment)；

14)检索号为P68871，基因注释为Hemoglobin subunit beta；

15)检索号为P02760，基因注释为Protein AMBP；

16)检索号为P01708，基因注释为Ig lambda chain V-II region BUR ；

17)检索号为M0R0W6，基因注释为Receptor protein-tyrosine kinase；

18)检索号为H0Y6F6，基因注释为Neuron navigator 1(Fragment)；

19)检索号为P05109，基因注释为Protein S100-A8；

20)检索号为P06702，基因注释为Protein S100-A9；

21)检索号为P19652，基因注释为Alpha-1-acid glycoprotein2；

22)检索号为E9PEV4，基因注释为Apolipoprotein E(Fragment)；

23)检索号为J3KSS0，基因注释为60S ribosomal protein L26；

24)检索号为H0Y7V6，基因注释为Pulmonary surfactant-associated protein B(Fragment)；

25)检索号为P69891，基因注释为Hemoglobin subunit gamma-1；

26)检索号为D6RGJ1，基因注释为Complement C1q subcomponent subunit B(Fragment)；

27)检索号为P05546，基因注释为Heparin cofactor 2；

28)检索号为Q5JV98，基因注释为Serine/threonine-protein kinase 24(Fragment)；

29)检索号为P02768，基因注释为Serum albumin；

30)检索号为A0A0C4DGV7，基因注释为Retinol-binding protein 4；

31)检索号为P12724，基因注释为Eosinophil cationic protein ；

32)检索号为Q86SG5，基因注释为Protein S100-A7A；

33)检索号为P08185，基因注释为Corticosteroid-binding globulin；

34)检索号为P55000，基因注释为Secreted Ly-6/uPAR-related protein 1；

35)检索号为P35606，基因注释为Coatomer subunit beta'；

36)检索号为P10599，基因注释为Thioredoxin ；

37)检索号为P22792，基因注释为Carboxypeptidase N subunit 2；

38)检索号为P04196，基因注释为Histidine-rich glycoprotein；

39)检索号为C9JEU5，基因注释为Fibrinogen gamma chain；

40)检索号为P02647，基因注释为Apolipoprotein A-I；

41)检索号为O60635，基因注释为Tetraspanin-1；

42)检索号为K7ERG4，基因注释为Small nuclear ribonucleoprotein Sm D2；

43)检索号为B4E1Z4，基因注释为Uncharacterized protein；

44)检索号为H7C5G1，基因注释为Isoamyl acetate-hydrolyzing esterase 1homolog(Fragment)；

45)检索号为P01024，基因注释为Complement C3；

46)检索号为A0A0C4DH34，基因注释为Protein IGHV4-28(Fragment)；

47)检索号为Q8TAI7，基因注释为GTPase RhebL1；

48)检索号为P02042，基因注释为Hemoglobin subunit delta；

49)检索号为P03952，基因注释为Plasma kallikrein；

50)检索号为A2A3R7，基因注释为40S ribosomal protein S6；

51)检索号为P53004，基因注释为Biliverdin reductase A；

52)检索号为P80188，基因注释为Neutrophil gelatinase-associated lipocalin；

53)检索号为P04114，基因注释为Apolipoprotein B-100；

54)检索号为Q5T985，基因注释为Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2；

55)检索号为A0A087WW53，基因注释为Coronin；

56)检索号为P02765，基因注释为Alpha-2-HS-glycoprotein；

57)检索号为P13489，基因注释为Ribonuclease inhibitor；

下调蛋白如下：

1)检索号为A0A0B4J2B8，基因注释为Protein IGHV1OR15-9(Fragment)；

2)检索号为F1T0C9，基因注释为Homeobox protein OTX2；

3)检索号为O15287，基因注释为Fanconi anemia group G protein；

4)检索号为A0A0C4DG37，基因注释为Zinc finger protein 439；

5)检索号为P27216，基因注释为Annexin A13；

6)检索号为A0A0G2JN42，基因注释为Mucin-6；

7)检索号为P51948，基因注释为CDK-activating kinase assembly factor MAT1；

8)检索号为C9JVB6，基因注释为Mitochondrial ribonuclease P protein 1(Fragment)；

9)检索号为H3BV17，基因注释为Phosphoglycolate phosphatase(Fragment)；

10)检索号为P02808，基因注释为Statherin；

11)检索号为Q70CQ2，基因注释为Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 34；

12)检索号为F5H8E1，基因注释为Probable ATP-dependent RNA helicase DHX37(Fragment)；

13)检索号为E9PBD8，基因注释为Lymphocyte-specific protein 1(Fragment)；

14)检索号为Q6ZWB5，基因注释为C3orf57protein；

15)检索号为Q8IUX8，基因注释为Epidermal growth factor-like protein 6；

16)检索号为Q9Y2P5，基因注释为Bile acyl-CoA synthetase；

17)检索号为H0YA69，基因注释为Matrix metalloproteinase-23(Fragment)；

18)检索号为F8WDF8，基因注释为Probable UDP-sugar transporter proteinSLC35A5；

19)检索号为Q14149，基因注释为MORC family CW-type zinc finger protein 3；

20)检索号为Q9P2G9，基因注释为Kelch-like protein8；

21)检索号为E5RJD9，基因注释为Uncharacterized protein C8orf34；

22)检索号为A0A0B4J278，基因注释为Alpha-1-antitrypsin(Fragment)；

23)检索号为P02814，基因注释为Submaxillary gland androgen-regulated protein3B；

24)检索号为E9PKW4，基因注释为Sulfotransferase；

25)检索号为A0A096LNJ1，基因注释为Protein LOC102724023(Fragment)；

26)检索号为Q99574，基因注释为Neuroserpin；

27)检索号为Q9BS26，基因注释为Endoplasmic reticulum resident protein 44；

28)检索号为Q9NY15，基因注释为Stabilin-1；

29)检索号为Q5T0V2，基因注释为Slit homolog1protein；

30)检索号为A0A075B6E2，基因注释为40S ribosomal protein S19；

31)检索号为Q6UXD5，基因注释为Seizure 6-like protein 2；

32)检索号为Q5VSN0，基因注释为SH3domain-containing kinase-binding protein1；

33)检索号为P06213，基因注释为Insulin receptor；

34)检索号为A0A0A0MS14，基因注释为Protein IGHV1-45(Fragment)；

35)检索号为E9PKP4，基因注释为Macrophage colony-stimulating factor 1(Fragment)；

36)检索号为Q8IUE6，基因注释为Histone H2A type 2-B；

37)检索号为P05154，基因注释为Plasma serine protease inhibitor；

38)检索号为Q9NQP5，基因注释为Coagulation factor XIII A chain(Fragment)；

39)检索号为E9PHY0，基因注释为Lysosomal acid phosphatase；

40)检索号为Q16836，基因注释为Hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase,mitochondrial；

41)检索号为A0A0A0MTL4，基因注释为Neuron navigator 2；

42)检索号为Q5T0R9，基因注释为Adenylyl cyclase-associated protein(Fragment)；

43)检索号为P35237，基因注释为Serpin B6；

44)检索号为P26022，基因注释为Pentraxin-related protein PTX3；

45)检索号为H3BUA5，基因注释为Uncharacterized protein(Fragment)；

46)检索号为B1AV70，基因注释为Protein YIPF(Fragment)；

47)检索号为Q5QPE4，基因注释为Sorting nexin-5(Fragment)；

48)检索号为F8W148，基因注释为Carbonic anhydrase 6(Fragment)；

49)检索号为E7EVW7，基因注释为Hematopoietic lineage cell-specific protein；

50)检索号为M0QZ70，基因注释为Intermediate conductance calcium-activatedpotassium channel protein 4(Fragment)；

51)检索号为P00480，基因注释为Ornithine carbamoyltransferase,mitochondrial；

52)检索号为B7ZKW8，基因注释为CapZ-interacting protein；

53)检索号为P01705，基因注释为Ig lambda chain V-II region NEI；

54)检索号为Q3MHB9，基因注释为Short transient receptor potential channel 4；

55)检索号为P18054，基因注释为Arachidonate 12-lipoxygenase,12S-type。