[发明专利]一种提高cyp3A5表达酶代谢活性的方法

说明书

本发明公开了一种基于酵母的CYP3A5生物反应器及其构建方法，其是通过将人源CYP3A5基因根据酵母密码子的编码偏好进行序列优化，而后利用基因工程技术将序列优化后的人cyp3A5及其氧化还原酶NADPH共转染到酵母工程菌株的基因组中，实现人cyp3A5及NADPH在毕赤酵母中的大量表达，药物通过通透性增加的酵母细胞壁进入胞浆，能够在酵母发酵培育过程中实现对特定药物进行选择性的代谢过程，构建基于基因工程酵母的药物代谢生物反应器，以生物合成的方法高效生产专一的药物代谢物；为药理学、毒理学研究提供了可靠的体外模型，为我国新药开发提供了一个新的研究平台。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测重组表达酶CYP3A5底物代谢活性的方法。

背景技术

在新药研究与开发过程中，药物的吸收、分布、代谢、排泄及其毒性(ADME/Tox)特征对于一个药物候选物最终成功起着至关重要的作用。细胞色素酶(cyp450)是非常重要的药物代谢I相酶，目前市面上大于85％的药物在人体内是由cyp450来代谢。传统的药物代谢研究以实验动物体内实验为主。近几年来，药物早期代谢研究进入到体外代谢的研究阶段：即利用重组cyp450酶在异源表达系统中进行表达，建立起体外筛选体系，进行体外代谢数据和性质到体内代谢数据和性质的预测，使现代新药研发具有了高通量、高效率、高准确性的特点。利用构建好的CYP药物体外筛选系统通过测定药物代谢的动力学参数及其产物性质，预测cyp450体内代谢水平，这是目前欧美各国在进行新药申报时必须进行的一项研究。

同时，美国FDA已对新药研发提出门槛更高的建议：对于大于药物总量的10％的代谢物要单独做毒性实验，当一种药物被cyp450酶代谢成数种活性代谢物时而且又是毒性活性代谢物，明显影响组织或靶组织反应时，应主要测定代谢物的浓度。因此，对代谢物进行定性和定量，是药物毒性评价和代谢动力学研究中最重要的步骤。但这些代谢物往往是毫克级的，运用标准的化学合成途径，需要鉴定其结构，分离其在化学合成中产生的异构体，通常非常复杂，合成过程需要数周，需消耗大量的人力物力。因此，利用酵母生物反应器进行生物合成代谢物，是传统的化学合成方法一个很好的替代手段，并且更具优势。

设想将人CYP450基因主要亚型(CYP3A4、CYP3A5、CYP2A6、CYP2C8以及CYP2C19)整合进生物体内，实现人CYP450基因主要亚型的稳定表达，以期能够在生物代谢过程中实现对特定药物的选择性代谢，生产专一的药物代谢物。可以对用生物方法生产专一的药物代谢物进行初步研究，同时为药理学、毒理学研究提供可靠的体外模型。在近年的研究中，用异源表达人CYP450s对药物代谢物的研究正逐渐成为热点，因为利用生物生产药物代谢物可能会是对传统的化学合成方法良好的替代手段并且更具环保优势。

CYP3A5的活性有很大的个体和种族差异性。CYP3A5代谢差异会造成药物利用度和清除率的差异，从而使药物疗效和毒性产生差异。在肝脏CYP3A5含量占CYP3A总量的一半以上。同时CYP3A5在肠、食管、胃、胆囊等多种器官和组织中表达，这也可能是其重要性的体现。CYP3A5在肿瘤组织中也有表达，增加了肿瘤组织中CYP3A的表达，提示可能与CYP3A5和肿瘤的发生和治疗有关，另外器官移植手术病人的免疫抑制剂的代谢也与CYP3A5多态性有重要关系。

然而，人CYP450酶系是一种膜蛋白，只能在胞内表达，药物需要进入细胞内才能被利用。酵母细胞壁却成为一道屏障，它能阻止大分子化学物质进入细胞。为了成功构建基于酵母的人CYP450体外表达模型，在酵母发酵过程中研究药物代谢情况，增加酵母细胞壁的通透性是使大分子药物能顺利通过细胞壁的有效途径。

CYP450代谢产物的生产目前基本采用化学合成方法，对合成的化合物需要一一鉴定其结构，分离其在化学合成中产生的异构体，通常非常复杂，合成过程需要数周，需消耗大量的人力物力。

发明内容