[发明专利]一种提高cyp3A5表达酶代谢活性的方法

权利要求书

1.一种提高重组人源cyp3A5酵母His⁺Mut⁺生物反应器的cyp3A5表达酶代谢活性的方法，其特征在于，所述方法是在活体重组人源cyp3A5酵母His⁺Mut⁺生物反应器中进行的，包括以下步骤：

(1)、将冻存的重组人源cyp3A5酵母His⁺Mut⁺生物反应器进行活化，经传代扩培后，酵母大量增殖；

(2)、甲醇诱导培养60～72h后，往BMMY培养基中加入3～6％的乙醚，同时加入100ul1mmol/L的睾酮24h-48h后，离心，分别收集上清和细胞；

(3)、用乙腈重悬细胞，超声破碎后，离心收集上清，即可进行检测。

2.根据权利要求1所述的提高重组人源cyp3A5酵母His⁺Mut⁺生物反应器的cyp3A5表达酶代谢活性的方法，其特征在于，所述重组人源cyp3A5酵母His⁺Mut⁺生物反应器是通过以下步骤构建得到的：

(1)、用XbaI酶切质粒pBS-2A，分别回收3.0kb PBS骨架片段和130bp的2A连接肽片段，将3.0kb骨架片段去磷酸化处理，重新连接选择反向克隆即得到载体pBS-2A(-)；将NADPH-细胞色素P450氧化还原酶基因POR定向插入所述载体pBS-2A(-)的Bgl II及Not I酶切位点之间，获得载体pBS-2A-POR；序列优化后的人源cyp3A5经PCR加A回收，两端带BamHI+XbaI，将其连接到PMD-19T simple，得到CYP3A5–PMD19T simple，将.CYP3A5–PMD19T simple和pBS-2A-POR分别用BamHI+XbaI双切处理，CYP3A5连接到pBS-2A-POR，得到载体pBS-CYP3A5-2A-POR；将载体pBS-CYP3A5-2A-POR进行BamH I和Not I双酶切，获得片段CYP3A5-2A-POR，将该片段插入酵母表达载体pPIC3.5K的BamH I/Not I位点，获得双表达载体pPIC-CYP3A5-2A-POR；

(2)、将双表达载体pPIC-CYP3A5-2A-POR线性化后，乙醇进行回收；

(3)、将感受态毕赤酵母GS115和线性化双表达载体pPIC-CYP3A5-2A-POR的混合物转移至预冷的BIO-RAD电转杯中，冰浴5～15min；进行电击；结束后立即加入冷的1M山梨醇溶液等待涂板；

(4)、MD初步筛选重组转化子后，再经PCR筛选重组转化子，经SDS-PAGE和Western blot法检测目的蛋白，即得重组人源cyp3A5酵母His⁺Mut⁺生物反应器。

3.根据权利要求2所述的提高重组人源cyp3A5酵母His⁺Mut⁺生物反应器的cyp3A5表达酶代谢活性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中双表达载体线性化是采用SalI酶进行的。

4.根据权利要求2所述的提高重组人源cyp3A5酵母His⁺Mut⁺生物反应器的cyp3A5表达酶代谢活性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中线性化的反应体系为：双表达载体30μL、10×BufferH 5μL、SalI酶5μL、ddH₂O 10μL。

5.根据权利要求2所述的提高重组人源cyp3A5酵母His⁺Mut⁺生物反应器的cyp3A5表达酶代谢活性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中乙醇回收的步骤为：向50μL已反应结束的体系中加入125μL体积的预冷的无水乙醇，然后加入冷的5μL的3M，PH＝5.2的醋酸钠溶液，在-20℃放置1h；12000rpm离心10min，然后用1mL 75％的酒精洗涤两次，12000rpm离心5min，烘干，用10～20μL超纯水溶解沉淀。