[发明专利]一种NAD类似物的还原方法

说明书

本发明公开了一种NAD类似物的还原方法及其应用。该方法中还原剂为甲酸化合物，催化剂为可利用甲酸化合物的甲酸脱氢酶，甲酸脱氢酶氧化甲酸化合物的同时，将NAD类似物转化为其还原态。该方法可用于生产还原态NAD类似物或氘代的还原态类似物，也可为消耗还原态NAD类似物的酶促反应提供还原力，还原态的NAD类似物可作为辅酶应用于苹果酸酶ME‑L310R/Q401C、D‑乳酸脱氢酶DLDH‑V152R、酿酒酵母醇脱氢酶等酶催化的还原反应，有利于NAD类似物的广泛应用。该NAD类似物还原方法可在温和条件下，再生还原态NAD类似物用于苹果酸或乳酸的制备；也可作为一种氧化还原力调控微生物体内苹果酸或乳酸的代谢强度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种NAD类似物的还原方法，具体地说，是以甲酸化合物为还原剂，在酶催化下将NAD类似物转化为其还原态，并可被其他酶用做辅酶应用于还原反应。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其还原态NADH是生命过程中的重要辅酶，参与生命体中的氧化还原代谢及其他一系列重要生物化学过程。这些辅酶可用于生产手性化学品及制备同位素标记物。由于很多氧化还原酶都利用NADH或NADPH作为辅酶，任何改变NAD浓度及其氧化还原状态的操作都会对细胞产生全局性影响，很难在辅酶水平对生物体系中特定的氧化还原酶进行控制。由于NADH可被代谢网络中多种途径消耗，影响了目标途径对还原力的利用效率。使用NAD类似物传递还原力时，由于类似物只能被突变型氧化还原酶识别，从而在辅酶水平对目标氧化还原过程进行调控，对生物催化和合成生物学研究具有重要意义(Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systems depending onnicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862；WangL,et al.Synthetic cofactor-linked metabolic circuits for selective energytransfer.ACS Catal,2017,7,1977-1983)。

目前已经报道了几种具有良好生物相容性的NAD类似物。如，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)、烟酰胺5-氟胞嘧啶二核苷酸(NFCD)、烟酰胺5-氯胞嘧啶二核苷酸(NClCD)、烟酰胺5-溴胞嘧啶二核苷酸(NBrCD)和烟酰胺5-甲基胞嘧啶二核苷酸(NMeCD)(Ji DB,etal.Creation of bioorthogonal redox systems depending on nicotinamideflucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862；Ji DB,etal.Synthesis of NAD analogs to develop bioorthogonal redox system.Sci ChinaChem,2013,56,296-300)。同时，也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如来自粪肠球菌Enterococcus faecalis的NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、D-乳酸脱氢酶(DLDH，Gnebank CAA47255)V152R突变体、苹果酸酶(ME，Genbank P26616)L310R/Q401C突变体、苹果酸脱氢酶(MDH，Genbank CAA68326)L6R突变体。