[发明专利]同步检测赭曲霉素、呕吐毒素和T‑2毒素的试纸卡、制备及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学检测领域，具体地，涉及同步检测赭曲霉素、呕吐毒素和T-2毒素的试纸卡、制备及检测方法。

背景技术

赭曲霉素、呕吐毒素和T-2毒素是常见的三种真菌毒素，以玉米为主的饲料、农产品易被其污染，动物摄入了霉变的饲料后，严重影响动物的生长、繁殖率和子代存活率。赭曲霉素(OTA)由赭曲霉和硫色曲霉产生，几乎可污染玉米、小麦等所有谷物，其急性毒性较强，实验证实赭曲霉素对动物具有致畸性。呕吐毒素的主体成分为脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)，主要来源于镰刀菌属，能够引起猪的呕吐，当人摄入了被DON污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。T-2毒素是单端孢霉烯族化合物中毒素最强的一种，能够通过多种途径对人和动物的多种组织和器官产生毒害作用，在动物体内的重要损害部位之一是肝脏，主要作用于细胞分裂旺盛的组织器官。这三种毒素严重威胁着动物和人类的健康，而建立一种快速、准确的同步检测粮食和饲料中赭曲霉素、呕吐毒素和T-2毒素的方法具有重要的意义。

目前有关赭曲霉素、呕吐毒素和T-2毒素的检测方法有薄膜层析和液相色谱等，此类分析方法虽然准确、稳定，但因成本高、操作繁琐、检测周期长等缺点，仅适用于检测机构而无法应用于实际生产生活。以简便快捷为优势的免疫检测技术是市场上应用最广泛的，其中，将荧光微球作为示踪物的免疫标记技术是本领域当前的研究热点。荧光微球是指将荧光物质引入到有机或无机纳米粒子中，纳米材料的包裹使其具有很好的稳定性。与同时发展起来的酶联免疫吸附(ELISA)和同类型的胶体金免疫层析技术比较，荧光微球免疫层析技术操作简便，更加快捷。尽管如此，在实际操作中，如何基于荧光微球制备更高标准的同步测定至少两种真菌毒素的试纸卡仍然存在现实的困难，因为在制备过程中，包括荧光微球的大小和修饰、抗体的选择、荧光微球与抗体的偶联效率等因素都会对结果造成影响，因此，制备灵敏性和稳定性等更高的同步检测至少两种真菌毒素的试纸卡仍然是意向重大的研究课题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供同步检测赭曲霉素、呕吐毒素和T-2毒素的试纸卡、制备及检测方法。

同步检测赭曲霉素、呕吐毒素和T-2毒素的试纸卡的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、检测垫的制备：制备浓度为0.5mg/mL的羊抗鼠单克隆抗体包被液，浓度为0.3mg/mL的赭曲霉素半抗原-牛血清白蛋白偶联物包被液，浓度为0.3mg/mL的呕吐毒素半抗原-牛血清白蛋白偶联物包被液，浓度为0.8mg/mL的T-2毒素半抗原-牛血清白蛋白偶联物包被液；将四种包被液各自单独吸至划膜机管线中，均按照0.8μL/cm在硝酸纤维素膜上依次划出质控线C、检测线T1、检测线T2和检测线T3；其中，羊抗鼠单克隆抗体包被液划出质控线C，赭曲霉素半抗原-牛血清白蛋白偶联物包被液划出检测线T1，呕吐毒素半抗原-牛血清白蛋白偶联物包被液划出检测线T2，T-2毒素半抗原-牛血清白蛋白偶联物包被液划出检测线T3；将经划线的硝酸纤维素膜置于37℃鼓风干燥箱中干燥3-4h，制得检测垫；

步骤二、结合垫的制备：将荧光微球分散液置于离心管中；加入MES缓冲液，在超声条件下混匀，离心弃上清收集微球沉淀，重复此步骤以清洗微球；将微球沉淀溶解于MES缓冲液中，混匀，加入EDC溶液，22-25℃避光活化，离心弃上清，加MES缓冲液，超声打散微球，离心弃上清；加入硼酸缓冲液，超声打散，然后依次加入赭曲霉素单克隆抗体、呕吐毒素单克隆抗体和T-2毒素单克隆抗体，避光反应；加入甘氨酸溶液，避光反应30min，再加入BSA溶液，避光反应30min，完成封闭；离心复溶，形成荧光微球-抗体复合物溶液；将荧光微球-抗体复合物溶液喷至玻璃纤维素膜上，干燥，制得结合垫；

步骤三、样品垫的制备：将玻璃纤维素膜放入配置好的样品垫处理液中，浸泡0.5h，放入37℃鼓风干燥箱中，干燥8-10h，制得样品垫；所述样品垫处理液为pH 7.4的PBS缓冲液，其中含有的成分及其浓度分别为：质量分数为0.5％的蔗糖，质量分数为0.5％的PVP-K30，质量分数为0.5％的PEG-20000，质量分数为0.1％的PEG-6000，质量分数为0.3％的干酪素，体积分数为0.5％的Tween 20，质量分数为0.1％的S9，质量分数为0.1％的S17和质量分数为0.1％的S21。