[发明专利]一种检测喹诺酮类抗生素的荧光微球免疫试纸卡、制备及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学检测领域，主要涉及一种检测喹诺酮类抗生素的荧光微球免疫试纸卡、制备及检测方法。

背景技术

喹诺酮类抗生素是一类人畜通用的药物，它是以细菌的DNA超螺旋酶为靶，妨碍此酶发挥超螺旋作用，造成细菌DNA的不可逆损害，使细菌细胞不再分裂。因其具有广谱抗菌性、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业的动物疾病预防和治疗中。随着动物养殖规模的不断扩大，养殖过程中盲目、过量使用抗生素导致动物源性食品中残留喹诺酮类药物，人食用后将对该药的严重抗药性，时刻威胁着人类健康。

目前有关喹诺酮类抗生素的检测方法是高效液相色谱法，此方法虽然灵敏度高、稳定，但因成本高、操作繁琐、检测周期长，仅适用于检测机构而无法应用于基层单位。另外荧光光谱、毛细管电泳等方法也有报道应用于检测喹诺酮类抗生素，但灵敏度不如免疫学检测方法。以简便快捷为优势的免疫检测技术是市场上应用最广泛的，其中，将荧光微球作为示踪物的免疫标记技术是本领域当前的研究热点。荧光微球是指荧光物质经过包埋、共价键连接等方式引入有机或无机纳米粒子中，纳米材料的包裹使其具有很好的稳定性。与应用广泛的酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒比较，荧光微球免疫层析技术无需配备酶标仪，操作简便，更加快捷。相比同类型的胶体金免疫层析技术，包埋大量荧光分子而使其具有更高的灵敏度；同时荧光信号通过荧光分析仪器检测能达到快速定量的效果。但是，如何利用荧光微球免疫层析技术检测或制备检测产品检测喹诺酮类抗生素残留至今并无文献明确记载，利用一种检测产品同时检测多种喹诺酮抗生素更是空白。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种检测喹诺酮类抗生素的荧光微球免疫试纸卡、制备及检测方法。该试剂盒能同时检测到16种喹诺酮类抗生素，且灵敏性好、特异性高、稳定性强，能不依赖实验室仪器和条件直接在户外或基层快速鉴定。

一种检测喹诺酮类抗生素的荧光微球免疫试纸卡的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、检测垫的制备：制备浓度为0.8mg/mL的羊抗鼠单克隆抗体包被液，浓度为0.4mg/mL的恩诺沙星-牛血清白蛋白偶联物包被液，将两种包被液各自单独吸至划膜机管线中，均按照0.8μL/cm在硝酸纤维素膜上依次划出质控线C和检测线T，其中，羊抗鼠单克隆抗体包被液划出质控线C，恩诺沙星-牛血清白蛋白偶联物包被液划出检测线T，将经划线的硝酸纤维素膜置于37℃鼓风干燥箱中干燥3-4h，制得检测垫。

步骤二、结合垫的制备：将荧光微球分散液置于离心管中，加入MES缓冲液，在超声条件下混匀，离心弃上清收集微球沉淀，重复此步骤以清洗微球，将微球沉淀溶解于MES缓冲液中，混匀，加入EDC溶液，22-25℃避光活化，离心弃上清，加MES缓冲液，超声打散微球，离心弃上清，加入硼酸缓冲液，超声打散，加入恩诺沙星单克隆抗体，避光反应，加入甘氨酸溶液，避光反应30min，再加入BSA溶液，避光反应30min，完成封闭，离心复溶，形成荧光微球-抗体复合物溶液，将荧光微球-抗体复合物溶液喷至玻璃纤维素膜上，干燥，制得结合垫。

步骤三、样品垫的制备：将玻璃纤维素膜平铺放入配置好的样品垫处理液中，浸泡0.5h，放入37℃鼓风干燥箱中，干燥8-10h，制得样品垫，所述样品垫处理液为pH 7.4的PBS，其中含有的成分及其浓度分别为：质量分数为0.5％的蔗糖，质量分数为0.5％的PVP-K30，质量分数为0.5％的PEG-20000，质量分数为0.1％的PEG-6000，质量分数为0.3％的干酪素，体积分数为0.5％的Tween 20，质量分数为0.1％的S9，质量分数为0.1％的S17和质量分数为0.1％的S21。

步骤四、试纸卡的组装：以PVC板为底板，将样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫依次搭接粘贴在底板上，每个相邻处搭接时有1-2mm重叠，并使检测垫上的检测线T靠近样品垫一侧、质控线C靠近吸水垫一侧，用切条机将贴好的PVC板切成条状，形成试纸条，将试纸条与卡壳组合，形成试纸卡，密封保存。

进一步的，步骤二所述荧光微球的粒径为200nm。

进一步的，步骤二所述荧光微球-抗体复合物溶液中，恩诺沙星单克隆抗体的浓度为3μg/mL。