[发明专利]一种检测喹诺酮类抗生素的荧光微球免疫试纸卡、制备及检测方法

权利要求书

1.一种检测喹诺酮类抗生素的荧光微球免疫试纸卡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、检测垫的制备：制备浓度为0.8mg/mL的羊抗鼠单克隆抗体包被液，浓度为0.4 mg/mL的恩诺沙星-牛血清白蛋白偶联物包被液，将两种包被液各自单独吸至划膜机管线中，均按照0.8μL/cm在硝酸纤维素膜上依次划出质控线C和检测线T，其中，羊抗鼠单克隆抗体包被液划出质控线C，恩诺沙星-牛血清白蛋白偶联物包被液划出检测线T，将经划线的硝酸纤维素膜置于37℃鼓风干燥箱中干燥3-4 h，制得检测垫；

步骤二、结合垫的制备：将荧光微球分散液置于离心管中，加入MES缓冲液，在超声条件下混匀，离心弃上清收集微球沉淀，重复此步骤以清洗微球，将微球沉淀溶解于MES缓冲液中，混匀，加入EDC溶液，22-25℃避光活化，离心弃上清，加MES缓冲液，超声打散微球，离心弃上清，加入硼酸缓冲液，超声打散，加入恩诺沙星单克隆抗体，避光反应，加入甘氨酸溶液，避光反应30 min，再加入BSA溶液，避光反应30 min，完成封闭，离心复溶，形成荧光微球-抗体复合物溶液，将荧光微球-抗体复合物溶液喷至玻璃纤维素膜上，干燥，制得结合垫；

步骤三、样品垫的制备：将玻璃纤维素膜平铺放入配置好的样品垫处理液中，浸泡0.5 h，放入37℃鼓风干燥箱中，干燥8-10 h，制得样品垫，所述样品垫处理液为pH 7.4的PBS，其中含有的成分及其浓度分别为：质量分数为0.5% 的蔗糖，质量分数为0.5% 的PVP-K30，质量分数为0.5% 的PEG-20000，质量分数为0.1%的PEG-6000，质量分数为0.3%的干酪素，体积分数为0.5%的Tween 20，质量分数为0.1%的S9，质量分数为0.1%的S17和质量分数为0.1%的S21；

步骤四、试纸卡的组装：以PVC板为底板，将样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫依次搭接粘贴在底板上，每个相邻处搭接时有1-2 mm重叠，并使检测垫上的检测线T靠近样品垫一侧、质控线C靠近吸水垫一侧，用切条机将贴好的PVC板切成条状，形成试纸条，将试纸条与卡壳组合，形成试纸卡，密封保存。

2.如权利要求1所述的一种检测喹诺酮类抗生素的荧光微球免疫试纸卡的制备方法，其特征在于：步骤二所述荧光微球的粒径为200 nm。

3.如权利要求1所述的一种检测喹诺酮类抗生素的荧光微球免疫试纸卡的制备方法，其特征在于：步骤二所述荧光微球-抗体复合物溶液中，恩诺沙星单克隆抗体的浓度为3 μg/mL。

4.如权利要求1-3任意一种所述的方法制备的检测喹诺酮类抗生素的荧光微球免疫试纸卡，其特征在于：试纸卡包括卡壳和设在卡壳内的试纸条，试纸条包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的吸水垫、检测垫、结合垫和样品垫；所述检测垫为设有质控线C、检测线T的硝酸纤维素膜，质控线C包被羊抗鼠单克隆抗体，检测线T包被恩诺沙星-牛血清白蛋白偶联物；所述结合垫为包埋时间分辨荧光微球标记的恩诺沙星单克隆抗体的玻璃纤维素膜；所述底板为不吸水的PVC板，吸水垫为吸水滤纸。

5.如权利要求4所述的一种检测喹诺酮类抗生素的荧光微球免疫试纸卡，其特征在于：所述卡壳包括相互扣合的卡盖和卡座，卡座内设有固定试纸条的卡槽，卡盖上对应于检测垫的区域设有视窗，卡盖上对应于样品垫的区域设有加样孔。

6.利用如权利要求5所述的荧光微球免疫试纸卡检测喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于：具体操作如下：

样品处理：称取经均质的固态样品置于离心管中，加入70%的乙酸乙酯溶液，振荡器剧烈震荡至少5 min，离心取上清，用氮吹仪吹干，形成凝结物，加入样品稀释液将凝结物溶解并稀释，得样品检测液；或将液态样品直接经样品稀释液稀释，得样品检测液；

测定：将样品检测液滴加到试纸卡的加样孔内，反应5 min，将试纸卡插入便携式荧光免疫分析仪中，读取T/C值，根据浓度标准曲线，计算得到对应样品中所检喹诺酮类抗生素的浓度。

7.如权利要求6所述的利用荧光微球免疫试纸卡检测喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于：所述样品稀释液为浓度0.02 mol/L的PBS溶液，其中含有体积分数为0.5%的甲醇。