[发明专利]一种链霉菌制备天赐霉素-A及其衍生物的发酵工艺

说明书

本发明涉及一种链霉菌制备天赐霉素‑A及其衍生物的发酵工艺，所述链霉菌为Streptomyces sp.CB03234‑S，已于2017年9月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017538。本发明通过对TNM‑A高产菌株CB03234‑S的发酵培养基进行系统优化，确定了适合其高效合成目标产物TNM‑A的优化培养基；在此基础上，在发酵罐中对上述微生物发酵制备方法进行中试放大，通过对温度、转速、pH值控制及原料补充控制等调控手段来建立和优化TNM‑A的微生物发酵制备工艺，最终通过对在发酵过程中发酵液溶氧的梯度控制(发酵前期控制发酵液溶氧为60‑80％，发酵中后期控制发酵液溶氧为40‑60％，pH为8.0‑9.0)和补料控制，进一步提高了TNM‑A的发酵产率，使得TNM‑A的产量突破20mg/L。

技术领域

本发明涉及一种链霉菌的发酵工艺，特别涉及一种用于制备天赐霉素-A及其衍生物的高产链霉菌的发酵工艺。属于生物医药技术领域。

背景技术

烯二炔类天然产物具有独特的共轭炔-烯-炔分子结构和超强生物活性，是最具开发前景的一类抗肿瘤抗生素，根据其核心结构可分为包括新制癌菌素(neocarzinotatin，NCS)、力达霉素(C-1027)、kedarcidin和maduropepti等在内的九元环烯二炔，以及包括卡奇霉素(calicheamicin，CAL)、esperamicin、dynemicin(DYN)和uncialamycin(UCM)等在内的十元环烯二炔。烯二炔类抗肿瘤抗生素的生物活性主要依赖于其诱导的DNA损伤机制，即通过电子重排形成暂时性苯环双自由基，对DNA小沟进行亲核攻击后形成以脱氧核糖核酸碳链为中心的自由基，并在分子氧的作用下引起单链或双链DNA的断裂。作为迄今为止发现的细胞毒性最强的一类分子，烯二炔类天然产物可作为抗肿瘤抗体偶联药物(ADC)的弹头分子，具有极高的成药前景。目前发现的12种烯二炔分子中，NCS、CAL和ozogamicin已被开发成为临床药物，其中由日本开发的SMANCS(聚苯乙烯马来酸共轭NCS)主要用于治疗肝癌，而美国辉瑞公司最近开发的ADC药物Mylotarg(CD33单克隆抗体偶联CAL)和Besponsa(CD22抗体inotuzumab偶联ozogamicin)则分别用于治疗急性骨髓性白血病和成人复发或难治性B细胞前体急性淋性白血病。

天赐霉素-A(Tiancimycin-A，缩略TNM-A)是2016年通过基因组挖掘技术从链霉菌(Streptomyces sp.CB03234，简称CB03234)的发酵产物中分离发现的一种新型十元环烯二炔抗肿瘤抗生素，其结构如下所示：

天赐霉素-A与UCM和DYN结构类似，对多种恶性肿瘤细胞有超高的活性，超过目前临床一线化疗药物丝裂霉素近千倍，并且表现出更快速和更完整的肿瘤细胞杀伤力，将是抗肿瘤ADC药物理想的弹头药物分子，该成果已发表在国际微生物权威期刊MBio.上(2016；7(6).pii:e02104-16)。TNM-A在原始菌株(Streptomyces sp.CB03234)中的产量极低，仅为0.3mg/L左右，而目前达到工业化制备水平的其它烯二炔类天然产物的产量均在20mg/L以上，因此现有TNM-A的来源远远不能满足临床研究和工业化生产的应用需求。同时TNM-A因其复杂独特的分子结构，无法通过传统的化学合成方法来获取，通过微生物发酵是目前制备TNM-A最切实可行的手段。此外，TNM-A从发酵液中的分离纯化仍采用乙酸乙酯萃取发酵上清液，丙酮破碎菌体后再经过乙酸乙酯萃取等传统手段，步骤繁多且过程中需要消耗大量的有机溶剂。因此，构建稳定的TNM-A高产菌株，并对其进行系统的发酵培养优化和建立放大规模的发酵调控工艺，可以大幅提高TNM-A产量，在此基础上通过高效的分离纯化方法获得足量的TNM-A来有效地解决其现阶段的发展瓶颈，加速推动TNM-A后继的抗癌活性分析、作用机理等临床前期研究以及抗肿瘤ADC新药的开发。

发明内容

本发明解决的技术问题是，提高TNM-A的产量，以满足工业化生产的应用需求。