[发明专利]一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒及其制备方法

权利要求书

1.一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)纳米荧光碳点的制备

将葡萄糖溶于水中，制成质量浓度为3-5g/mL的葡萄糖水溶液，加入PEG200，搅拌均匀后置于微波炉中，于800W条件下微波加热3-5min，冷却至室温，用水稀释，透析过夜，再过0.45μm滤膜，用去离子水稀释，得到浓度为2.5-3.5g/mL的纳米荧光碳点溶液；其中葡萄糖溶液和PEG200的体积比为2-5:8-20；

(2)荧光碳点表面巯基化修饰

将纳米荧光碳点溶液、EDC、和NHS混合，搅拌活化30-40min，接着加入胱胺避光反应过夜，反应结束后，将所得溶液透析24h，每4h换一次透析液，收集透析后的溶液，加入DTT搅拌过夜，将反应所得液再次透析48h，每4h换一次透析液，收集透析液，冷冻干燥后得巯基化的纳米荧光碳点；其中纳米荧光碳点、EDC、NHS、胱胺和DTT的摩尔比为8-10:1.8-2.2:1.8-2.2:0.8-1.2:3-7；

(3)精氨酸-赖氨酸接枝的二代肽类树状分子的制备

将甲酯保护的赖氨酸、N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸、EDC·HCl和HOBT加入反应容器中，抽真空-氮气循环三次，然后加入二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入DIEA，在室温下反应24h，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用HCl、NaOH水溶液和饱和NaCl溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥，旋蒸浓缩，纯化，得甲酯和N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)保护的肽类二代树状分子；其中甲酯保护的赖氨酸、N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸、EDC·HCl、HOBT和DIEA的摩尔比为1:2-3:2-3:2-3:6-9；

脱甲酯保护：将上述产物溶解于NaOH/MeOH溶液中，室温下搅拌反应6-7h，旋蒸除去混合物中的MeOH，加入CHCl₃溶解残余物，在搅拌状态下滴加HCl调节溶液pH值至2-3，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥过夜，过滤后旋蒸除去溶剂，减压浓缩后得脱甲酯后的二代树状分子；

连接胱胺：将脱甲酯后的二代树状分子、胱胺、HBTu和HOBT置于反应容器中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入DIEA，在室温下反应20-24h，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，然后依次用HCl、NaOH水溶液和饱和NaCl溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥过夜，旋蒸浓缩出固体产物；其中脱甲酯后的二代树状分子，胱胺，HBTu，HOBT，DIEA的摩尔比为2-3:1-1.5:2-4:2-4:6-9；

脱保护：取上述产物置于反应容器中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8h，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得脱保护后的精氨酸-赖氨酸接枝的二代肽类树状分子；

(4)荧光碳点表面修饰二代肽类树状分子

将巯基化的纳米荧光碳点和步骤(3)所得物混合，加入0.01M，pH＝8的硼酸缓冲液溶解，封口后在室温下反应4-6h，收集反应液，透析48h，再过0.45μm滤膜，收集滤液，冷冻干燥得到产物；其中巯基化的纳米荧光碳点和步骤(3)所得物的质量比为1:1.5-2.5；

(5)两性离子聚合物聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的制备

以羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯作为反应单体，2-溴代异丁酸乙酯为引发剂，1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺为配体，置于反应容器中，真空-氮气循环三次，加入甲醇和N,N-二甲基甲酰胺以体积比为1：1的混合物，然后再加入溴化亚铜，密封，于60℃反应24-24h，然后透析，冻干后得产物；其中单体、引发剂、配体和溴化亚铜的摩尔比为40-50:1-1.5:2-2.5:1-1.5；

(6)载药碳点的制备

将步骤(4)所得产物和抗肿瘤药物溶于水中，避光反应4-8h，然后透析24h，每4h换一次透析液，收集透析后的溶液，冷冻干燥后得到包载药物的荧光碳点；其中抗肿瘤药物和步骤(4)所得产物的质量比为1:3-5；

(7)载药纳米粒的制备

将步骤(5)制得的产物与步骤(6)制得的产物以质量比1:2-3混合，在去离子水中搅拌过夜，将得到的混合液过0.45μm滤膜，收集滤液，冷冻干燥得到载药纳米粒。