[发明专利]一种高效二元液相色谱法检测畜禽组织中γ-氨基丁酸含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及γ-氨基丁酸含量检测技术领域，且特别涉及一种高效二元液相色谱法检测畜禽组织中γ-氨基丁酸含量的方法。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)又称氨酪酸、哌啶酸，其分子式为C₄H₉NO₂，分子量为130.12。γ-氨基丁酸是一种非蛋白质氨基酸，广泛分布于动植物体内。目前，γ-氨基丁酸在医学上研究较为深入的作用是一种重要的抑制型神经递质，具有增进脑活力、安神、调节激素分泌、改善脂质代谢、降血压等生物学功能。基于γ-氨基丁酸的上述功能，其被广泛应用在畜禽养殖业中，γ-氨基丁酸主要是作为一种中枢镇静剂，例如，γ-氨基丁酸被添加在猪饲料中，用来对猪的生长性能进行调控。

在研究GABA在畜禽养殖业中的应用时，通常需要对畜禽产品中的GABA进行检测。目前常用的GABA检测方法有薄层色谱、纸层析法、比色法、氨基酸分析仪测定、毛细管电泳-电化学检测、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)。各种方法均有其优缺点，其中薄层层析方法灵敏度高、检测方便，但是检测耗时比较长；纸电泳法成本较低，无需昂贵的试剂以及仪器，缺点是需要控制温度、pH以及滤纸本身性质等的影响，操作过程繁琐；纸层析法简单有效费用低廉，缺点是精密度不高，检测时间较长；氨基酸分析仪检测准确、简便省时、稳定性好，缺点是设备昂贵、对样品的纯度要求很高，测定条件需要严格控制；毛细管电泳法灵敏度高、成本低、试剂用量少，但是操作过程过于复杂；高效液相色谱法精确度和灵敏度均很高，可满足大部分科研和生产过程中检测的需要。

国内外测定γ-氨基丁酸的高效液相色谱法的检测对象多为γ-氨基丁酸含量较高的脑组织或血清，且多用邻苯二甲醛作为衍生剂，在催化剂作用下与组织中的氨基酸发生衍生化反应，生成的衍生物经高效液相分离，再通过电化学检测或荧光检测器检测。这种检测方法的检测结果准确性较低，而且无法直接得到畜禽主要产品——肉中的γ- 氨基丁酸含量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效二元液相色谱法检测畜禽组织中γ-氨基丁酸含量的方法，可直接检测出畜禽组织中的γ-氨基丁酸残留，检测结果准确性高。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种高效二元液相色谱法检测畜禽组织中γ-氨基丁酸含量的方法，其包括以下步骤：

称取畜禽组织，加入液氮，待畜禽组织冷却坚硬后进行研磨，再加入液氮、研磨，如此反复多次，直至畜禽组织完全粉碎；加入样品稀释液，高速离心，取上清液过微孔滤膜，得滤液；

将滤液冷冻干燥，加入调节溶液，冷冻干燥，调节溶液是由甲醇、乙酸钠和三乙胺按质量比2～3：2～3：1组成；再加入衍生化试剂，衍生化试剂是由异硫氰酸苯酯、甲醇、乙醇、三乙胺和水按照质量比 1～2：5～6：1～2：1～2：1组成，于室温衍生后经冷冻干燥，得样品；

将样品用样品稀释液复溶，得试样，将试样及标样注入高效液相色谱仪进行分析，得样品和标样的色谱图，根据色谱图计算样品中γ- 氨基丁酸含量。

进一步地，在本发明较佳实施例中，样品稀释液为4～6mmol/l 的Na₂HPO₄缓冲溶液，pH＝7～8。

进一步地，在本发明较佳实施例中，畜禽组织和第一次加入的样品稀释液的用量比为0.1g：350～450μL。

进一步地，在本发明较佳实施例中，滤液、调节溶液、衍生化试剂和复溶用的样品稀释液的用量比为2～3：1：2～3：3～5。

进一步地，在本发明较佳实施例中，高速离心的方法是：于 10000～13000r/min离心3～10分钟。

进一步地，在本发明较佳实施例中，微孔滤膜的滤孔为0.4～0.5μm 滤膜。

进一步地，在本发明较佳实施例中，在检测前，由畜禽取下的畜禽组织需放入液氮中，再转移到-20℃以下的冰柜中冷冻保存。

进一步地，在本发明较佳实施例中，样品在复溶前，置于2～6℃中保存。