[发明专利]一种敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：将靶向EGFR的嵌合抗原受体CAR‑EGFR的编码基因与载体相连，进行重组慢病毒的构建，并转染CD3阳性T淋巴细胞，将转染后的T细胞的PD1基因进行敲除，得到敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞。所述敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，具有高效且特异性的杀伤肿瘤细胞的性能，并且对正常细胞不会造成损伤，同时人源化单链抗体制得的敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞能够更好的维持嵌合抗原受体T细胞的活力和杀伤力。

技术领域

本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

人上皮生长因子受体(EGFR)是人上皮生长因子的主要受体。在激活后，EGFR会发生同源二聚，或与其他人上皮生长因子受体家族的成员发生异源二聚，从而诱导EGFR细胞内结构的自磷酸化，并激活下游通路例如丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)通路等，并介导细胞扩增。研究表明EGFR是一个在肺癌等多种实体瘤细胞中表达或异常表达，而在普通细胞中表达很微弱的细胞表面抗原。EGFR与肿瘤细胞的增殖、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。在癌症中，变异的EGFR得到持续性的激活，从而引起细胞无节制的扩增并最终导致癌症。因此，EGFR是一个癌症特异性靶点。

程序性死亡蛋白(PD1)是表达于T细胞和前体B细胞膜上的受体蛋白的一种，属于免疫球蛋白超家族。PD1是免疫检查点抑制(immune checkpoint in hibition)中的代表性分子，在机体免疫中通过阻止T细胞激活来负向调节免疫反应，以防止自身免疫疾病并保证自体耐受。在肿瘤微环境中，PD1会抑制杀伤性T细胞的活性，从而使肿瘤细胞逃脱免疫监视。

免疫细胞治疗是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，其治疗肿瘤具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势弥补了传统疗法的弊端，在国内外已经用于临床治疗恶性肿瘤，嵌合抗原受体T细胞技术(CAR-T)为当前过继性细胞回输治疗技术最新的免疫细胞技术之一，因其能够在体内能激活自身免疫系统，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到清除恶性肿瘤细胞的目的而受到广泛的关注和研究。目前还未有靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞且可避免肿瘤细胞逃脱免疫监视的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞，所述敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，具有高效且特异性的杀伤肿瘤细胞的性能，更好的维持细胞的活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤，同时人源化单链抗体制得的敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞能够更好的维持嵌合抗原受体T细胞的活力和杀伤力。

第一方面，本发明提供了一种敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：

(1)提供靶向EGFR的嵌合抗原受体CAR-EGFR的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向EGFR的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向EGFR的单链抗体为人源化单链抗体，所述靶向EGFR的单链抗体的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)将所述CAR-EGFR的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPX LD-CAR-EGFR重组质粒；

(3)包装所述pWPXLD-CAR-EGFR重组质粒，得到重组慢病毒；

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得嵌合抗原受体T细胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因，获得敲除PD1的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞。