[发明专利]一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法

说明书

本发明公开了一种酶反应合成1,2,4‑丁三醇的方法，其特征在于，以D‑木糖脱氢酶、D‑木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶为催化剂，在反应体系中催化D‑木糖转化为D‑1,2,4‑丁三醇；所述反应体系包括如下组分：50mM PBS(NaHPO₄、NaH₂PO₄)、MgCl₂6mM、NAD⁺0.5mM、NADH 0.5mM、TPP 0.4mM。本发明通过控制各个酶的酶量，提高了体外合成丁三醇的能力，解决了微生物法合成法带来的副产物多，后续分离工艺复杂等不利影响。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法。

背景技术

D-1,2,4-丁三醇是无色无味、透明、粘稠的四碳多元醇。工业用的D-1,2,4-丁三醇是重要的有机合成中间体，广泛应用于医药、农业、化妆品、造纸、高分子材料、烟草、军工等领域。D-1,2,4-丁三醇的硝基化合物冲击敏感性低、热稳定性好、低毒性、吸湿性好，与其它含能增塑剂混合使用，可显著提高以硝化纤维素为基火药的低温力学性能。

目前国内外1,2,4-丁三醇的生产主要通过化学合成实现，但化学法反应条件严苛、成本高、生成副产物多等一系列弊端限制其大规模生产。随着DNA技术和合成生物学的发展，生物转化合成丁三醇具有反应条件温和、过程安全环保的优点，不论是对环境还是经济都有很大的意义。

2003年，Niu^[8]等在大肠杆菌中构建了异源代谢途径，利用氧化酶氧化D-木糖生成D-木糖酸，产率70％，D-木糖酸再经催化生成D-1,2,4-丁三醇，产率为25％，由木糖到丁三醇的总产率为17.5％。Frost等利用木糖途径生产丁三醇，不敲除任何副产物途径，丁三醇的产量仅有0.08g/L。Kris等敲除了木糖醇的副产物途径后，产量0.25g/L，这两种情况丁三醇转化效率较低。

虽然微生物法合成丁三醇研究的较为广泛，但是由于微生物的代谢途径复杂，且发酵过程不易调控，副产物多等多种因素，导致丁三醇的产量、产率低且后续的分离工艺较为复杂。通过无细胞体外纯酶反应，可以在体外建立最佳反应体系，通过添加辅因子，控制各个酶的酶量，研究最佳反应条件如温度、pH、金属离子等，最终获得产物丁三醇。体外纯酶反应具有反应条件易控制，无底物、中间产物的毒性问题，能获得更高的产品得率和纯度，其工业化前景巨大。目前尚未有文献报道以木糖为底物，利用纯酶进行体外反应获得D-1,2,4-丁三醇。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，以解决现有技术中D-1,2,4-丁三醇生产成本高、转化率低的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，以D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶为催化剂，在反应体系中催化D-木糖转化为D-1,2,4-丁三醇；

所述反应体系包括如下组分：20～100mM PBS(NaHPO₄、NaH₂PO₄)、MgCl₂ 1～10 mM、NAD⁺0.1～0.8mM、NADH 0.1～0.8mM、TPP 0.1～0.6mM；

D-木糖脱氢酶催化木糖生成D-木糖酸；D-木糖酸脱水酶催化D-木糖酸生成3-脱氧-D-甘油戊酮酸；苯甲酰甲酸脱羧酶催化3-脱氧-D-甘油戊酮酸生成D-3,4-二羟基丁醛；醇脱氢酶催化D-3,4-二羟基丁醛生成D-1,2,4-丁三醇。