[发明专利]一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法

权利要求书

1.一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，以D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶为催化剂，在反应体系中催化D-木糖转化为D-1,2,4-丁三醇；所述反应体系包括如下组分：20～100mM PBS、MgCl₂ 1～10mM、NAD⁺ 0.1～0.8mM、NADH0.1～0.8mM、TPP 0.1～0.6mM；

所述D-木糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示；D-木糖酸脱水酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示；苯甲酰甲酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示；醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .4所示；

所述D-木糖脱氢酶的含量为200～400U/mL，所述D-木糖酸脱水酶的含量为100～300U/mL，苯甲酰甲酸脱羧酶的含量为100～300U/mL，醇脱氢酶的含量为200～350U/mL。

催化反应的温度为33～37℃，反应时间为12～24h；

所述的D-木糖的浓度为10～25g/L。

2.根据权利要求1所述的酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，所述D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶的制备方法如下：

(1)将SEQ ID NO.1～4所示的核苷酸序列分别导入质粒中，得到重组质粒，然后将重组质粒分别转化宿主菌，得到重组菌；

(2)在重组菌中分别诱导表达D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶；

(3)利用超声波破碎仪破碎各重组菌菌体，分别收集粗酶液，再利用镍柱对D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶进行纯化，收集纯化后的酶液，利用超滤管对其进行除盐和浓缩，即分别得到D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶。

3.根据权利要求2所述的酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，步骤(3)中，利用镍柱纯化D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶的方法如下： 利用PBS缓冲液分别将各重组菌重悬，超声破碎重组菌，得到4种酶的粗酶液，将粗酶液 分别从镍柱中流出，使蛋白结合在镍柱上，然后利用结合缓冲液洗脱杂蛋白，再用洗脱缓冲 液洗脱目标蛋白；所述的结合缓冲液的配方如下：20mM Tris、0 .5M NaCl、50mM咪唑，HCl调至pH7.0； 所述的洗脱缓冲液的配方如下：20mM Tris、0 .5M NaCl、500mM咪唑、HCl调至pH7.0。

4.根据权利要求2所述的酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的质粒为PRSF Duet-1。

5.根据权利要求2所述的酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。