[发明专利]一种烟草对南方根结线虫抗性的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种鉴定烟草对南方根结线虫是否存在抗性的鉴定方法的专利申请。

背景技术

烟草根结线虫病是世界各国烟草生产中的常见病害之一，在我国发生范围最广、危害重、防治难度较大，严重制约了我国烟草行业的发展。根结线虫与其他植物病原物（真菌、细菌、病毒）相比，其能够主动侵袭寄生和自行转移，同时还能与有些病原物形成互作，引起复合病害，也就是说，根结线虫具有双重性病原的特点。研究人员在2005年调查了全国烟草病虫害发生情况，统计结果表明：我国15个主要烟叶生产省中，烟草根结线虫病共发生面积17.981万亩，相当于每亩减产大约30%~50%左右。因此，如何有效地防治根结线虫病已成为当前我国烟叶生产中急需解决的问题。

受种植环境和生产成本等因素的限制，大部分缺水旱作烟区无法开展防治效果较好的水旱轮作，从而多采用化学手段防治根结线虫病。虽然取得一些较好的效果，但也造成了农药高残留、高毒性、烟叶品质的下降和环境污染的结果。同时较长时间采用化学防治使得根结线虫产生抗药性。

选育和推广抗病品种是防治烟草根结线虫病最经济有效的方法之一，种植抗病品种不仅可以降低根结线虫种群密度，保证烟农的基本利益，而且可以降低化学农药的使用，改善土壤理化结构，维持烟区的健康可持续发展。而烟草对根结线虫病抗病性鉴定是烟草抗线虫育种的前提和基础。

目前我国烟草抗根结线虫鉴定主要通过田间病圃和人工接种方式进行鉴定。田间病圃自然诱发鉴定法是在大田烟叶生长前期接种，收获期拔根调查，导致了其鉴定周期较长，容易受环境条件影响；另外田间病圃自然诱发鉴定法，难以适应大量种质材料的抗病性鉴定，极大地限制了抗病育种的有效开展。人工接种诱发鉴定法与田间病圃自然诱发鉴定法一样具有鉴定周期长的特点，且人工接种诱发鉴定法无法完全模拟田间气候变化，所以在准确性方面不如田间病圃自然诱发鉴定法，需要采用田间病圃自然诱发鉴定法验证鉴定结果。另一方面，应用人工接种诱发鉴定法时，以虫液、卵液作为接种对象时，需要对线虫形态和数量进行准确鉴定和计数，对操作技术要求较高。而且应用人工接种诱发鉴定法的前提是需要对供试的根结线虫经单卵块繁殖纯化，准确鉴定其种或小种，并要对试验小区（或盆）加强管理，排除其它病虫害等因素对试验的干扰。

总之，以上两种鉴定技术难于适应大量育种材料鉴定的需求，限制了抗病育种的有效开展，这是目前我国烟草抗根结线虫病育种急需解决的问题。

发明内容

针对现有传统的抗性鉴定技术难于适应大量育种材料鉴定的需求，且鉴定结果受环境影响较大、鉴定周期长、准确性不高的缺陷，本申请目的在于提供一种无损伤的、新的烟草根结线虫病抗性鉴定方法，从而实现简单、准确、快速、高通量的烟草抗根结线虫（南方根结线虫）的抗性筛选鉴定。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种烟草对南方根结线虫抗性的鉴定方法，其主要技术原理为：已有研究发现烟草抗南方根结线虫品种与感染PVY-MSNR（马铃薯Y病毒，PotatoVirusY，PVY）产生枯斑是同一基因所致，且PVY-MSNR复制酶（PVY-NIB）是烟草叶片接种PVY-MSNR病毒后在抗南方根结线虫品种上产生枯斑的诱导因子；基于这一发现，本申请首先人工合成PVY-MSNR复制酶基因，并构建PVX病毒（马铃薯X病毒，potato virus X，PVX）瞬时表达系统，将这一表达系统通过农杆菌介导浸润烟草叶片后，在抗南方根结线虫烟草品种上即会发生过敏性坏死反应，而在感南方根结线虫烟草品种上则不会出现症状，根据这一表型差别来鉴定不同烟草品种对南方根结线虫的抗性；具体步骤如下：

（一）人工合成PVY-NIB基因，并构建瞬时表达载体PVX:pND108-NIB；具体而言：

首先，人工合成PVY-NIB基因，为便于后续瞬时表达载体的构建，在合成制备PVY-NIB基因（cDNA）时，在序列的5'端加入有Notl酶切位点，在序列的3'端加入有SalI酶切位点，所述PVY-NIB基因，包括1578bp，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：