[发明专利]牛呼吸道合胞体G蛋白特异性核酸适配体

说明书

本发明涉及一种牛呼吸道合胞体G蛋白特异性核酸适配体、其应用及其筛选方法，属于生物工程领域。本发明通过微孔板法不同轮次筛选获得多条G蛋白的核酸适配体候选物，选择测序结果出现频次较高的适配体，用I‑ELAA法测定了其与G蛋白的结合力，五条适配体G‑6、G‑13、G‑39、G‑55和G‑72的KD值分别为34.17±2.1nM、28.33±2.07nM、48.09±1.05nM、32.06±2.27nM和25.27±1.34nM，二级结构预测显示核酸适配体均具有稳定的颈环状或发卡状结构，说明本次筛选的五条适配体均能与G蛋白特异、稳定的结合，可用于后续检测牛呼吸道合胞体抗原或抗体的酶联适配体法的建立。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种牛呼吸道合胞体G蛋白特异性核酸适配体。

背景技术

指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand byexponential enrichment,SELEX)是一种能获取与靶物质特异结合的寡核苷酸的筛选技术，筛选得到的单链DNA或RNA分子称为核酸适配体。核苷酸不仅有储存和传递遗传信息的作用，还可以通过自身特有的空间结构与其它分子相互作用。在适宜条件下，单链DNA或RNA分子会发生适应性折叠，形成发夹、凸环、四分体等结构，从而与靶物质紧密结合。因此，近年来，具有高特异性、高亲和力、高稳定性、低免疫原性、低分子量、易于合成等特点的核酸适配体，得到了广泛的应用。微孔板法是将靶分子通过物理吸附作用结合于微孔板上，加入适配体文库孵育后弃去未结合的适配体，洗脱与靶分子结合的适配体即可；该方法适用靶分子广，对靶分子性状要求不严格，凡是能特吸附至微孔板的物质均可进行筛选。然而，对于不同的靶物质应采用适当的筛选方法，以便快速、准确地筛选到亲和力高、特异性强的适配体。

牛呼吸道合胞体病是由牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytialvirus，BRSV)引起的一种急性、热性呼吸道传染病。该病能影响犊牛的生长发育，可使肉牛增重减缓及乳牛泌乳量显著下降，15-18月龄牛发病率高达80％-100％，在一些牛场急性感染牛的死亡率可达20％。BRSV可通过再次感染或携带者在畜群中持续存在，使其治疗费用不断增加，给养牛业造成了重大的经济损失。牛呼吸道合胞体病的早期准确诊断，不但能够减少经济损失，而且可以有效的控制该病的发生和蔓延，具有长远的社会效益。要保证养牛业快速、健康、稳定的发展，就要加强对该病的诊断和防制。因此，建立一种低成本同时具有较高的敏感性和特异性的适合中国国情的牛呼吸道合胞体病诊断方法对养牛业甚至是畜牧业的发展具有很重要的意义。

牛呼吸道合胞体G蛋白为N-和O-糖基化的II型糖蛋白，含有257个氨基酸，包括N-端的胞浆区、疏水的锚定区和外功能区。G蛋白是病毒主要的吸附蛋白，抗G蛋白的特异性抗体可以阻止病毒与细胞的结合，同时G蛋白也是牛呼吸道合胞体病毒的主要保护性抗原之一。为了得到牛呼吸道合胞体G蛋白高结合力和特异性的核酸适配体，我们采用了较为传统的微孔板法，进行了改进和优化。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的可用于识别牛呼吸道合胞体G蛋白的核酸适配体，还相应地提供所述核酸适配体的筛选方法与应用。对牛呼吸道合胞体核酸适配体筛选方法进行改进和优化，该筛选方法具有适用靶分子广，对靶分子要求不严格，操作简便，节约成本等优点。同时运用该方法筛选获得的G蛋白核酸适配体，为后续检测牛呼吸道合胞体抗原或抗体的酶联适配体法的建立奠定了基础。

本发明采用如下技术方案：

牛呼吸道合胞体G蛋白核酸适配体筛选方法，包括如下步骤：

步骤一：设计和合成初始寡核苷酸文库及用于PCR扩增的上游引物和下游引物；

步骤二，包被：吸取G蛋白溶液包被于微孔板中；

步骤三，洗板：甩去包被液，洗涤微孔板，甩干；