[发明专利]诱导胚性愈伤组织的方法

说明书

本发明涉及一种诱导胚性愈伤组织的方法，包括以下步骤：用灭菌试剂对种子进行灭菌；用灭菌后的种子作为诱导愈伤的材料，接种于诱导愈伤组织的第一培养基上，并进行光照培养；将光照培养后的愈伤组织转移至第二培养基上进行继代培养，获得胚性愈伤组织。该方法简单易行，能够高效获得大量胚性愈伤组织。

技术领域

本发明涉及一种诱导胚性愈伤组织的方法，特别是用于菜心种子的快速诱导胚性愈伤组织的方法。

背景技术

菜心(BrassicacampestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsenetLee)为十字花科芸薹属特产蔬菜，以花苔为食，是我国华南地区蔬菜作物的重要组成部分，目前在全国普遍种植，并远销港澳、东南亚各国。菜心生长周期短，容易种植，已成为科研的重要材料。当前菜心遗传转化的主要手段是通过农杆菌侵染子叶或花穗，这些方法存在菜心转化率低，转基因不稳的问题。当前尚没有任何关于菜心愈伤的诱导技术和操作方法。因此，提供一种简便、可操作的菜心胚性愈伤组织诱导技术具有重要的现实意义。

发明内容

基于以上现有技术的问题，本发明提供了一种诱导胚性愈伤组织的方法，通过采用灭菌、光照培养和继代培养来快速高效地大量获得胚性愈伤组织。

根据本发明的一个方面，提供一种诱导胚性愈伤组织的方法，包括以下步骤：

用灭菌试剂对种子进行灭菌；

用灭菌后的种子作为诱导愈伤的材料，接种于诱导愈伤组织的第一培养基上，并进行光照培养；

将光照培养后的愈伤组织转移至第二培养基上进行继代培养，获得胚性愈伤组织。

根据一个实施方式，所述灭菌步骤包括依次用70％v/v乙醇和1.5wt％次氯酸钠水溶液处理所述种子。

优选地，所述光照培养进行12～16天。

根据本发明的另一个实施方式，所述继代培养为每10天继代一次，连续继代至少3次。

根据本发明的又一个实施方式，所述第一培养基和所述第二培养基独立地为MS(Murashig和Skoog培养基)+2.0mg/L6-BA(6-Benzylaminopurine，6-苄氨基嘌呤)+0.5～1.0mg/LNAA(1-Naphthaleneaceticacid，萘乙酸)+4.0mg/LAgNO₃+6～8g/L(相当于质量体积比为0.6～0.8％)琼脂粉+25～30g/L(相当于质量体积比为2.5～3％)蔗糖。

优选地，所述第一培养基和所述第二培养基的pH分别为5.7～5.8。

具体地，所述光照培养和所述继代培养的每日光照条件分别为14小时光照后，继续10小时黑暗，光照强度在1000～2000勒克斯之间，温度为20～25℃。

根据本发明的又一个实施方式，在灭菌步骤之后、光照培养步骤之前，用无菌去离子水清洗灭菌后的种子1至2次。

优选地，所述种子为菜心种子。

本发明与现有技术相比，具有优点如下：

1、首次成功诱导了菜心胚性愈伤组织，用本方法胚性愈伤获得率在90％以上。

2、以无菌的菜心种子作为愈伤诱导材料，简单方便，避免了种植无菌苗，再以无菌苗的叶为侵染受体的繁琐程序。

3、光照培养与继代培养所用培养基一致，且在相同环境中进行，诱导愈伤组织效果良好，简单、易行、高效地获得了胚性愈伤组织。

附图说明

图1示出了在实施例1中根据本发明的诱导胚性愈伤组织的方法对菜心种子进行光照培养14天后所得的菜心愈伤组织。