[发明专利]一种人参自毒物质人参皂苷降解菌筛选的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌种筛选技术领域，具体涉及一种人参自毒物质人参皂苷降解菌筛选的方法。

背景技术

随着科技的发展，近几年来，农业种植重茬病害日益严重。人参是国家一级重点保护植物，作为“东北三宝”之一，其同样受到重茬病害的危害。很多资料显示，人参重茬的主要原因是由于其本身自毒物质的存在，而人参皂苷是人参主要自毒物质，土壤中人参皂苷的存在导致种过一茬人参后的地块基本都不能再连续种植，需要整地、修整之后才能基本恢复正常种植，否则出苗率极低，且易发生根腐病等严重病害。但是目前该方法时间成本较高，大大减少了人参的正常产量，若改在其他地方载种人参，由于气候环境的差异，又会使人参缺少很多道地药材的药用价值，质量不能得到保证。

因此，找到一种合适的方法降解人参自毒物质是极其必要的，但是要求其既不能对人参的正常生长有副作用，又不能污染环境、对环境造成危害。利用微生物对土壤中的人参皂苷进行降解是一种不会造成污染的方法，且能够解决人参重茬病害问题。

发明内容

针对以上技术缺陷，本发明的目的是提供一种能够降解种植人参时土壤中自毒物质人参皂苷的菌种的筛选方法，进而解决人参自毒物质人参皂苷对人参生长产生的重茬障碍。

为达到上述的技术目的，本发明提供的一种人参自毒物质人参皂苷降解菌筛选的方法采用以下技术方案：

步骤一：人参皂苷降解菌的初步筛选

（1）取50mL培养基加入2mg/mL83%的人参皂苷标准样品溶液1mL，制备多组样品液，向其中分别接入不同菌种；

（2）将（1）中的多组处理样品分别于34℃条件下以220rpm的速度摇床培养24h，之后由高速冷冻离心机以12000rpm的速度离心20min；

（3）分别取（2）中的上清液于60℃旋转蒸发器旋转蒸干；

（4）将（3）中所得的各蒸干固体用甲醇溶解定容至10mL；

（5）将（4）所得溶液分别由高速冷冻离心机以12000rpm的速度再次离心20min；

（6）取（5）中所得的各上清液分别由0.45μm微孔滤膜过滤，超声5min排除气泡后，利用反相高效液相色谱法检测各组样品中人参皂苷的含量，以人参皂苷含量最低为判断标准筛选出具有最优人参皂苷降解效果的菌种；

步骤二：人参皂苷降解菌对人参皂苷降解效果的进一步判定：

（1）选用步骤一筛选出的人参皂苷含量最低的菌种为进一步的实验菌种；

（2）取两瓶100mL的LB培养基，分别向其中加入2mg/mL83%的人参皂苷标准样品溶液1mL，其中一瓶设置为对照，另一瓶接入步骤一筛选出的人参皂苷降解菌菌种；

（3）两瓶实验样品均于34℃条件下以220rpm的速度摇床培养48h；

（4）每隔两天跟踪检测各实验样品中的人参皂苷含量，其中，每一次检测取10mL发酵液，在6℃条件下由高速冷冻离心机以10000rpm的速度离心20min；

（5）分别取上清液于0.45μm微孔滤膜过滤，超声5min排除气泡后利用反相高效液相色谱法检测人参皂苷的含量，从而判定所筛选菌种对人参皂苷降解效果的有效性。

其中，所述反相高效液相色谱法检测人参人参皂苷的含量的方法包括：

（1）色谱条件：

色谱柱C18，流动相:乙腈+水=35+65，波长：203nm，柱温：35℃，流速:1.00mL/min，进样量：10μL；

（2）标准曲线的绘制：

a、取0.04mg/mL98%标准样品溶液分别进样2、4、6、8、10μL，

b、取0.06mg/mL98%标准样品溶液分别进样5、10μL，

c、取0.08mg/mL98%标准样品溶液进样10μL，

d、取2.00mg/mL98%标准样品溶液分别进样2、4μL，进而获得标准曲线。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：