[发明专利]一种基于Hochest333258的肿瘤细胞增殖检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是指一种基于Hochest333258标记肿瘤细胞的细胞增殖检测方法和用途。

背景技术

肿瘤的增殖水平与肿瘤细胞恶性程度密切相关，是抗肿瘤研究和治疗的重要检测指标。在抗肿瘤药物筛选、鉴定和肿瘤治疗靶点研究中，肿瘤细胞增殖水平检测是基础研究手段。目前普遍采用的方法是：以体外培养的肿瘤细胞系为模型，以MTT法、CCK-8法、细胞计数法或结晶紫染色法等方法检测经药物处理、基因调控等条件干预一段时间后，肿瘤细胞的存活数量。然后通过与处理前或对照组细胞相比较，计算肿瘤细胞的存活率或抑制率。

上述方法是目前最普遍应用的细胞增殖分析方法，其原理是：MTT法利用活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶将外源性MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并堆积在细胞内，然后以DMSO溶解甲瓒，通过检测甲瓒的吸光度来间接反映存活细胞的相对数量。CCK-8法则是利用活细胞内脱氢酶在1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的存在下催化WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)脱氢生成水溶性甲瓒，然后通过检测甲瓒的吸光度来间接反映存活细胞的相对数量。细胞计数法通过细胞稀释后直接计数然后乘以稀释倍数反映细胞数量。结晶紫染色法则利用结晶紫为阳离子和其碱性特性将其溶于甲醇溶液中，直接进入细胞内和带负电荷的蛋白质以及酸性DNA结合，从而直接将细胞染为紫色。然后通过检测结晶紫的吸光度来直接反映细胞的相对数量。

上述方法的优缺点是：

MTT法和CCK-8法利用活细胞内酶的作用，因而能够反映活细胞的数量，避免死细胞的干扰。但其缺点是某些处理条件可能导致细胞内酶活性改变，从而直接影响实验结果。此外，该方法处理步骤较多，容易导致实验误差增加。CCK-8和MTT实验的各个复孔数据通常标准差较大，易导致数据因误差而无统计学差异，因而对实验操作要求较高。

细胞计数法优点是直观、简便，但是无法进行高通量的多样本操作，不适用于药物筛选等大样本对照分析，因此应用极为有限。此外，由于细胞需消化成单个细胞悬液，因而实验误差较大。

结晶紫染色法优点是最为简便，但是无法区分活细胞和死细胞而且受残留结晶紫染液和染色效率的干扰，实验误差也较大。

鉴于上述原因，目前仍亟需提供新的细胞增殖分析方法。

发明内容

本发明的目的提供一种基于Hochest333258的肿瘤细胞增殖检测方法和应用，通过该方法，实验简便易行、重复性和准确性高。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种基于Hochest333258的肿瘤细胞增殖检测方法，包括以下步骤：

传代培养肿瘤细胞至细胞培养板，细胞经计数后进行倍比稀释得到不同细胞个数的梯度系列，在培养基中进行常规培养，然后加入含Hochest333258的溶液，混匀后静置一段时间，弃去细胞培养基，用PBS缓冲液洗去残余培养基后再加入PBS缓冲液，最后检测荧光值，通过荧光信号强度来判断细胞增殖水平或存活率。

进一步地，所述的肿瘤细胞为人非小细胞肺癌A549细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞或小鼠黑色素瘤B16-F1细胞。

进一步地，所述的倍比稀释时，形成的不同细胞个数的梯度系列为10000、5000、2500、1250、625、312/孔；同时每个梯度设置多个复孔。

进一步地，所述的培养基为体积分数为10％小牛血清的DMEM培养基，培养条件为：95％湿度、37℃、体积分数5％CO₂，培养时间为24小时。

进一步地，所述含Hochest333258的溶液是将Hochest333258溶解在体积分数为50％DMSO中，先配置成浓度10mM的母液；加入含Hochest333258的溶液后，培养基中的含Hochest333258浓度为10μM；混匀后静置时间为10min。

进一步地，所用的PBS缓冲液的加入量为100μL/孔，检测时设置100μl/孔PBS缓冲液的孔作为空白对照。

进一步地，检测设备为荧光酶标仪，检测波长为340nm。

本发明还涉及Hochest333258在肿瘤细胞增殖检测中的应用。