[发明专利]一种肝素化丝素蛋白膜及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肝素化丝素蛋白膜及其制备方法，肝素以共价键高密度接枝到丝素蛋白膜表面，能显著提高丝素蛋白材料的抗凝血性能，属于生物医用材料领域。

背景技术

蚕丝蛋白是一种天然的高分子，由蚕绢丝腺内壁上的内皮细胞分泌的高纯度结晶性蛋白质。丝素蛋白材料具备良好的力学性能、生物相容性以及较低的免疫原性，且可被生物降解，在生物医药与再生医学领域具有良好的应用前景。近年来丝素基材料被广泛用于制备人工血管，人工心脏等支架。然而，作为外源性的植入物，丝素蛋白材料会直接与组织液或血液接触，血小板与血浆蛋白会吸附、聚集在材料表面，进而引发凝血，形成血栓。因此，如何构建具有良好的抗凝血性能的表面是丝素蛋白作为血液直接接触型生物材料面临的关键问题。

迄今为止，用于提高丝素蛋白材料抗凝血性能的策略主要有水蛭素改性，内皮化，硫酸化以及肝素化等。其中肝素化是应用最广且是最有效的增强丝素蛋白材料抗凝血性能的方法。丝素蛋白表面肝素化的方法主要包括物理共混，表面涂层及共价接枝等。公开号为CN1255189C的中国发明专利“一种抗凝血性不溶性丝素材料的制备方法”中，将肝素溶解在丝素蛋白溶液中制备成的肝素-丝素共混膜具有较好的抗凝血性能。“Improved hemocompatibility of silk fibroin fabric using layer-by-layer polyelectrolyte deposition and heparin immobilization” [J. Appl.Polym. Sci., 2014, 131(18)] 一文中，首先利用聚丙烯氯化铵和聚丙烯酸经过层层静电自组装技术在丝素纤维表面形成聚电解质层，然后将低分子量的肝素涂层在带正电荷的丝素纤维表面，能显著降低血浆蛋白的吸附，有效地提高丝素材料的抗凝血性能。“Cytocompatibility and blood compatibility of multifunctional fibroin/collagen/heparin scaffolds” [Biomaterials ，2007，28(14)：2306-2313]一文中，将肝素、丝素蛋白与胶原共混制备成的支架材料体外能较明显地延长凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）及活化部分凝血活酶时间（APTT），但支架上的肝素在4天内基本释放完全。

在上述已公开的现有技术中，将肝素通过表面涂层、物理共混等方法固定在丝素蛋白材料的表面，是依靠分子间静电相互作用或者氢键，结合力弱，肝素分子易于脱落，突释现象明显，有效的抗凝血时间较短。因此，将肝素共价接枝到丝素蛋白材料表面上以提高其抗凝血性及其持久性，是改善丝素蛋白材料抗凝血性能的重要途径。然而，丝素蛋白分子链上的碱性氨基酸含量仅约为0.87 mol%，其中侧链上带有自由氨基的精氨酸和赖氨酸的含量分别仅约为0.46和0.22 mol%，这就使得能与肝素分子链上的羧基反应的自由氨基数目有限，难以达到在丝素蛋白膜表面高密度共价接枝肝素的目的。

发明内容

本发明针对丝素蛋白表面自由氨基数量少及现有的丝素蛋白肝素化改性技术存在的不足，提供一种能有效将肝素以共价键高密度接枝到丝素蛋白膜表面，具有良好的抗凝血活性的肝素丝素蛋白膜及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是提供一种肝素化丝素蛋白膜的制备方法，先将蚕丝经脱胶、溶解、透析后得到再生丝素蛋白溶液，制成丝素蛋白膜，再经乙醇溶液处理，得到水难溶性的丝素蛋白膜，再进行如下步骤的处理：

（1）将水难溶性的丝素蛋白膜置于低温等离子体反应室内，预抽真空至5～10 Pa，通入气体清洗后，开启射频电源，用低温等离子体对丝素蛋白膜表面进行处理，通入气体的流量为10～100 cm³/min，反应室内压强为20～100 Pa，射频功率为5～200 W，处理时间为1～60 min；所述的气体为氮气或氨气，或它们的混合气体；

（2）关闭射频电源，继续通入气体5～60 min后取出样品；

（3）将肝素钠溶解于pH值为4.5～6.5的缓冲溶液中，配制成浓度为0.1～20.0 mg/mL的肝素钠溶液，再加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺，肝素钠溶液中的N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺的浓度分别为10～50 mM和5～20 mM；