[发明专利]一种杂交瘤细胞过滤灌流培养制备抗体的方法

说明书

本发明提供一种杂交瘤细胞过滤灌流培养制备抗体的方法，包括以下步骤：步骤1：使用无钙镁离子ThermoFisher无血清杂交瘤培养基浸泡过夜；步骤2：超净台中2e7杂交瘤细胞悬浮于60‑100ml无血清培养基中；步骤3：消毒浸泡好1g微载体约4.3e6个微球悬浮于60‑100ml无血清培养基中；步骤4：分别吸取微载体和细胞混合入过滤器，实现细胞接种一个微载体；步骤5：持续补料和出液；步骤6：过滤出澄清的抗体培养液收集。本发明方法，解决了杂交瘤染菌安全问题，细胞交叉污染，单抗混杂培养基血清牛抗，灌流方式培养条件适用不同的细胞株，单抗产品生产安全重复性好。

技术领域

本发明属于分析检测试剂盒技术领域，尤其涉及的是一种杂交瘤细胞5 过滤灌流培养制备抗体的方法。

背景技术

杂交瘤单抗广泛应用于医疗诊断试剂，以及各种分析检查试剂盒中。国内各实验室也自制多种杂交瘤抗体。杂交瘤细胞是半贴壁细胞，既可以10 细胞瓶贴壁培养，又可以细胞反应器悬浮培养。如要大量制备单抗，须进行细胞反应器杂交瘤细胞高密度培养。工业制备单抗使用生物反应器微载体悬浮/固定床培养大量生产；或中空纤维反应器灌流培养。单位体积内细胞数量越多，细胞存活时间越长，单抗的浓度就越高，产量就越大。

诊断试剂市场需求抗体种类多，而用量少，阶段使用量均在几百毫克15 到1g左右；所以市场上大部分诊断试剂抗体使用小鼠生产腹水单抗，腹水中有宿主其他鼠源抗体难以分开，细胞培养基添加的牛血清和腹水中的其他鼠源抗体，都会导致诊断单抗假阳性。而为减少培养血清中的牛IgG对单抗的影响，实验室使用半透膜细胞培养瓶培养，工业使用微囊包裹杂交瘤细胞反应器培养法。现在无血清培养基的大量运用，彻底解决了培养血20清中牛IgG混杂在产品抗体中难题，是杂交瘤单抗培养制备方向。由于杂交瘤贴壁特性，一般使用杂交瘤细胞贴附微载体后悬浮培养需要复杂昂贵的微载体悬浮培养细胞反应器；若驯化半贴壁杂交瘤细胞为悬浮细胞，需要在无血清培养基中逐代驯化筛选高产量的克隆细胞系，费时费力，如果不是大品种高产量的单抗品种，很少有用生物反应器培养。 25

因此，市场大量需求制备几百毫克到1g生产规模，无血清无宿主抗体干扰的单抗培养装置，满足小规模多种类简单方便的无血清培养需求。

发明内容

为解决现有技术中出现的问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞过滤灌流培养制备抗体的方法。

本发明的技术方案如下：

一种杂交瘤细胞过滤灌流培养制备抗体的方法， 包括以下步骤：

步骤1：将1g Cytodex1微载体100ml无钙镁离子磷酸盐缓冲液浸泡过夜，上清倾倒换液；121度30分钟高压灭菌后；在超净台中倾倒PB上清，使用无钙镁离子ThermoFisher 无血清杂交瘤培养基浸泡过夜；

步骤2：超净台中2e7杂交瘤细胞悬浮于60-100ml无血清培养基中；

步骤3：消毒浸泡好1g微载体约4.3e6个微球悬浮于60-100ml无血清培养基中；

步骤4：分别吸取微载体和细胞混合入过滤器，实现细胞接种一个微载体；

步骤5：持续补料和出液，经过循环过滤灌流培养3-4天，细胞密度达到1-4e6/ml, 透气袋中的培养基营养成分消耗，乳酸和氨堆积，需要持续向储液透气袋中补充无血清培养基和DMEM/F12混合培养基；过滤灌流出的培养液不再循环回到储液透气袋，通过滤器底部三通阀排出和收集；通过无血清培养基不断淋洗去除原细胞培养体系中的血清，为下一步抗体收集准备；

步骤6：6-7天后滤器中细胞密度1e7/ml, 微载体上细胞已铺满表面，控制维持灌流培养基葡萄糖含量为0.8g/L、乳酸含量<2g/L、氨含量<8mM, 抑制细胞继续扩增，加大抗体分泌，过滤出澄清

的抗体培养液收集。