[发明专利]苯酚降解微生物菌剂、固定化小球及制备方法

权利要求书

1.一种苯酚降解微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选取自来水厂的生物锰砂滤池的表层滤料，对所述表层滤料接种和活化培养制备第一菌液；

(2)将第一菌液接种至含锰MSVP液体培养基中培养，生成黑褐色颗粒物，制成第二菌液，其中，含锰MSVP液体培养基为加入有Mn²⁺浓度为20-40mg/L的MnCl₂的MSVP液体培养基，pH为7.25-7.3；

(3)将第二菌液接种至含锰MSVP固体培养基中，倒置培养，生成黑褐色颗粒物，挑取生成黑褐色颗粒物的菌落接种至1-3％TSB培养基，活化后制成微生物菌剂，其中，含锰MSVP固体培养基为加入有0.1-0.5mL Mn²⁺浓度为1g/L的MnCl₂溶液的MSVP固体培养基，pH为7.25-7.3。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，接种和活化培养方法包括以下步骤：

(11)选取的自来水厂的水源为高锰地下水，将所述表层滤料接种至加入2.38g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、pH为7.25-7.3的LB培养基中，活化12-24h；

(12)将活化后的菌液再次接种LB培养基中培养12-24h，制备所述第一菌液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述第一菌液在含锰MSVP液体培养基中的接种量按体积计为1-1.5％，接种时OD600值为0.9-1.1，培养温度为25-28℃，培养时间为12-24d；

所述步骤(3)中，所述第二菌液在含锰MSVP固体培养基中的接种量为0.5-1mL，接种时OD₆₀₀值为0.9-1.1，培养温度为25-28℃，培养时间为10-20d；筛选的菌落在1-3％质量含量的TSB培养基中在25-28℃温度下，活化12-24小时。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)，中含锰MSVP液体培养基成分为：(NH₄)₂SO₄0.24g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L，无水CaCl₂0.06g/L，KH₂PO₄0.02g/L，Na₂HPO₄·12H₂O0.03g/L，丙酮酸钠0.24g/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.38g/L，VB₁₂0.002g/L，Mn²⁺浓度为20-40mg/L的MnCl₂，pH为7.25-7.3；

所述步骤(3)中，含锰MSVP固体培养基成分为：(NH₄)₂SO₄0.24g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L，无水CaCl₂0.06g/L，KH₂PO₄0.02g/L，Na₂HPO₄·12H₂O0.03g/L，丙酮酸钠0.24g/L，琼脂2-5％，4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.38g/L，VB₁₂0.002g/L，Mn²⁺浓度为1g/L的MnCl₂溶液0.1-0.5mL，pH为7.25-7.3；

所述含锰MSVP固体培养基的制备方法为：向灭菌后的含有(NH₄)₂SO₄、MgSO₄·7H₂O、无水CaCl₂、KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O、丙酮酸钠、琼脂的培养基中加入过0.22μm灭菌滤膜的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和VB₁₂混匀、凝固后，加入MnCl₂溶液并使MnCl₂溶液在培养基表面涂匀，静置使Mn²⁺渗透至培养基中。