[发明专利]AAVS1位点定点整合外源基因的人iPS细胞的构建方法

说明书

本发明提供了一种AAVS1位点定点整合外源基因的人iPS细胞的构建方法，其包括：构建含有外源基因的第一重组质粒，并将其包装得到第一rAAV；构建含有AAV Rep78的第二重组质粒，并将其包装得到第二rAAV；第一rAAV和第二rAAV共同转导人成体细胞，将外源基因定点整合于人成体细胞19号染色体的AAVS1位点。采用本发明技术手段得到的基因工程化人成体细胞株能够稳定表达外源基因，将得到的基因工程化人成体细胞株在体外诱导成多能干细胞，能保持干细胞的多能性及分化潜能，并且稳定表达外源基因。本发明可用于赋予细胞新的功能，或用于纠正/补偿由于基因异常/缺陷所引起的疾病，或为干细胞基因治疗提供一种可行的方法。

技术领域

本发明涉及人iPS细胞的一种构建方法。更具体地说，本发明涉及一种AAVS1位点定点整合外源基因的人iPS细胞的构建方法。

背景技术

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS细胞)是一类由分化的体细胞(如成纤维细胞，血细胞)经过重编程而生成的细胞。iPS细胞与胚胎干细胞一样，几乎能够分化形成所有类型的细胞；而iPS细胞的来源与胚胎干细胞不同，iPS细胞来自于分化的体细胞，而非胚胎，可避免使用胚胎干细胞的伦理学上的争议。iPS细胞与成体干细胞也不同，成体干细胞是在人体中自然产生，数量较少，限制了其在生物医学中的应用。

2006年，日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)发明了将小鼠的成纤维细胞诱导生成多能干细胞的方法，他利用逆转录病毒载体将四个转录因子Oct-3/4、SOX2、c-Myc和Klf4转入分化的体细胞中，使其重新编程得到了iPS细胞[参见Takahashi K,Yamanaka S,2006.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adultfibroblast cultures by defined factors.Cell 126:663-676]。2007年，他将该方法应用到了人类皮肤成纤维细胞[参见Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,Narita M,IchisakaT,Tomoda K,Yamanaka S,2007.Induction of pluripotent stem cells from adulthuman fibroblasts by defined factors.Cell 131:861-872]，山中伸弥教授也因此获得了2012年诺贝尔医学生理学奖。James Thomson的研究组也同时报道了用慢病毒载体引入Oct4、Sox2加Nanog和LIN28这四个因子诱导产生人类iPS细胞[参见Yu J,Vodyanik MA,Smuga-Otto K,Antosiewicz-Bourget J,Frane JL,Tian S,Nie J,Jonsdottir GA,RuottiV,Stewart R,et al.2007.Induced pluripotent stem cell lines derived from humansomatic cells.Science 318:1917-1920]。2009年James Thomson的研究组使用非整合型附着体载体将成纤维细胞诱导生成iPS细胞，去除非整合型附着体后得到的iPS细胞中不含有外源基因，这是iPS细胞将被应用于生物医学的一大进步[参见Yu J,Hu K,Smuga-OttoK,Tian S,Stewart R,Slukvin II,Thomson JA,2009.Human Induced Pluripotent StemCells Free of Vector and Transgene Sequences.Science 324:797-801]。2013年北京大学生命科学学院邓宏魁教授和赵扬博士带领的研究团队使用小分子化合物诱导体细胞重编程为iPS细胞，开辟了一条全新的实现体细胞重编程形成iPS细胞的途径[参见Hou PP,Li YQ,Zhang X,Liu C,Guan JY,Li HG,Zhao T,Ye JQ,Zhao Y,Deng HK,2013.Pluripotentstem cells induced from mouse somatic cells by small-moleculecompounds.Science 341:651-654]。