[发明专利]一种从人脐带血血清中分离制备抗氧化活性成分的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从人脐带血血清中分离制备一种具有抗氧化活性成分的方法（分子量为10KDa以下），属于细胞及生物工程领域。

背景技术

抗氧化物质是一类能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害的一类物质。人体的抗氧化剂可来自于自身合成，也可由食物供给。科学研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联。研究抗氧化可以有效克服其所带来的危害，所以抗氧化被药品、保健品、护肤品生产企业及其他日用化工生产企业列为研发方向之一，也是市场最重要的功能性诉求之一。由于传统采用化学工艺合成的抗氧化剂如BHA、BHT等具有毒副作用，因而其在产品中的添加量被各国严格控制。来自于动植物组织中的天然的抗氧化剂将有效解决化学合成抗氧化剂的毒副作用问题。

脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在脐带中的血液，通常是废弃不用的。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源。脐带血具有多种优点，其未受到放射、药物、毒物、病菌或其他污染；容易采集、不具备伤害性、不会对产妇及新生儿产生不良影响且来源丰富。脐带血血清是脐带血干细胞生长、发挥生理作用的重要组成部分，内含多种细胞因子和营养因子，已有研究表明，脐血血清中含有能够促进刺激细胞生长、延缓表皮细胞衰老的表皮生长因子（EGF）；最新研究表明其含有能够治疗炎症和败血症的名为新生儿NET抑制因子(nNIF)的特殊多肽；此外还含有维生素E、过氧化物酶等抗氧化，保护细胞免受自由基侵害的物质。

本发明从脐带血血清中提取出具有抗氧化活性的有效成分，该成分来源于人体组织，安全性高，抗氧化性能好，有望应用于药品、保健品及护肤品中。

发明内容

本发明仅采用离心超滤的方法对人脐带血血清成分进行分离，并对各不同级分中所含有的有效成分进行了研究，结果发现，脐带血血清的低分子量级分（分子量为10KDa以下）具有优异的抗氧化功能，它能有效清除DPPH自由基，羟基自由基及超氧阴离子自由基，同时所含有的丰富的物质还具有营养细胞的功效。该方法分离方式简单，分离成本低廉，分离物有望应用于药品、保健品、护肤品等日用化工品中，制备成多种形式的产品。

本发明提供的一种具有抗氧化活性的脐带血血清分离物，制备步骤如下。

步骤一：脐带血血清的制备：正常剖宫产手术或顺产过程中，无菌条件下取脐带血，取脐带血过程中不加抗凝剂。将脐血注入到无菌玻璃瓶中，1℃～5℃静置4～8小时，待血液凝固后，于1℃～5℃，1000g～3000g离心力的条件下离心，搜集上清液，继续离心，重复2～4次，搜集上清液储存备用，同时留取2～3mL血清于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养3天，进行微生物检测。无菌生长的合格血清方可进行步骤二。

步骤二：将滤液稀释后采用不同规格的超滤管进行离心超滤，于1℃～5℃，2000g～5000g的条件下超滤收集各不同级分进行抗氧化实验，评估各不同级分的抗氧化效果，最终获得具有抗氧化功效的分子量小于10KDa的分离物。将具有抗氧化功效的成分进行分装，冻干备用。

步骤三：分离物抗氧化活性的测定。

（1）清除DPPH自由基能力的测定。

取分离物冻干粉配制成不同浓度的样品溶液，测定分离物对DPPH自由基的清除能力。具体步骤为：向离心管中分别加入2 mL不同浓度梯度的样品溶液，再分别加入2 mLDPPH溶液（95%乙醇配制，0.1 mmol/L），混合均匀后避光反应30分钟。在517nm处测定吸光值A。上述步骤不加入DPPH，向每个试管中加入2 mL95%乙醇，其余步骤不变测得数据A₁。向离心管中加入2 mL纯化水和2 mLDPPH溶液，其余步骤不变，测得吸光值A₀。以纯化水为空白，每个样品做3个平行试验，取平均值，计算公式如下：

DPPH自由基清除率=[1-(A-A₁)/A₀]×100%。

（2）羟基自由基清除能力的测定。