[发明专利]一种D‑N‑氨甲酰水解酶及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种D-N-氨甲酰水解酶及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-色氨酸(D-Trp)作为一种重要的手性化合物，常被用来合成一些医药中间体，还可以用作非营养型甜味剂，在食品行业倍受欢迎。

D-N-氨甲酰水解酶是属于腈水解酶超家族的第6类，它可以将D-N-氨甲酰氨基酸水解得到的D-氨基酸，常被用来与海因消旋酶和海因酶构成级联反应制备光学纯的D-氨基酸。

1998年Yamamoto等人，利用D-N-酰胺酶选择性地水解D-色氨酰胺之后通过化学水解得到D-Trp(Yamamoto et al.Method for producing D-tryptophan,1998,European patent,EP0853128A1)。类似于酰胺酶方法，1957年Greenstein，等人利用L-氨基酰化酶制备D-Trp，其中只有N-乙酰基-DL-色氨酰胺中的L-对映异构体被水解，剩余的对映异构体可通过化学法脱乙酰化形成D-Trp(Greenstein,J.P.,Methods In Enzymology,1957,3:554–570)。1995年，Yamamoto H等人报道可以D-色氨酸酶从DL-Trp外消旋体中降解L-Trp产生D-Trp，但是该反应的副产物丙酮酸和吲哚可抑制色氨酸酶的活性，因而需要去除(Kawasaki et al.Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1995,59:1938–1943)。目前报道的这些方法都存在理论产率为50％，过程复杂，产率低和对映选择性等缺点。尽管在1949年，Eadie G等人报道可以由D-氨基酸转氨酶使得底物吲哚丙酮酸和D-丙氨酸反应的方法来制备光学纯D-Trp，该方法理论产率为100％，但是活性低，而最终的产率仅为13％(Eadie G et al.Journal ofBiological Chemistry,1949,181:449–458)。海因酶过程是一个由海因消旋酶，海因酶和氨甲酰水解酶组成的三酶级联反应，由于其可以打破传统的50％转化率的限制，而且拥有较高的得率，一直以来被认为是高效经济制备光学纯D-氨基酸的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对已经报道的氨甲酰水解酶的可溶性差以及对底物D-N-氨甲酰色氨酸的低催化活性等问题，提供一种新的氨甲酰水解酶，其具有良好的可溶性，对D构型的氨甲酰氨基酸底物表现出高立体选择性，并对D-N-氨甲酰色氨酸具有高的催化活性。

本发明的第一个目的是提供一种氨甲酰水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述氨甲酰水解酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明的第三个目的是提供携带编码所述氨甲酰水解酶基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述氨甲酰水解酶的细胞系。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞是表达氨甲酰水解酶的重组大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以BL21(DE3)为宿主，以pET28a为载体，表达SEQ ID NO.1所示基因。

本发明的第五个目的是提供制备所述细胞系的方法，包括如下步骤：

1)采用化学合成或PCR方法克隆编码所述氨甲酰水解酶的基因AshyuC；

2)将步骤1)获得的AshyuC基因与质粒pET28a同时用限制性核酸内切酶BamH I和EcoR I双酶切，然后使用T4DNA连接酶进行连接，获得重组表达载体pET28a-AshyuC；

3)将步骤2)获得重组表达载体pET28a-AshyuC转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-AshyuC。

本发明的第六个目的是提供一种氨甲酰水解酶的制备方法，所述方法是培养所述细胞系，获得重组的氨甲酰水解酶。

在本发明的一种实施方式中，培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞的类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生D-氨甲酰水解酶即可。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述细胞系在LB培养基中培养。

在本发明的一种实施方式中，LB培养基含有：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。