[发明专利]一种活性虫草酵素的制备方法

权利要求书

1.一种活性虫草酵素的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)液体培养基的选择

液体培养基成分按照重量比，组成如下：

a、碳源10-20％，

b、氮源10-20％，

c、无机盐为K₂HPO₄和M_gSO₄·7H₂O，K₂HPO₄为0.04-0.1％，M_gSO₄·7H₂O为0.01-0.07％，

d、其他为VB1，透明质酸和去离子水，VB1为0.002-0.005％，透明质酸0.2-0.5％，去离子水补到100％；

2)虫草菌种的移植和保藏

移植培养的操作过程，将加了凝固剂的液体培养基pH值调到6.0，灭菌后倾斜放入无菌操作台得到斜面固体培养基，冷却后接种虫草菌种，接种后的试管放入恒温培养箱中，在25℃下培养7d；保藏，菌种放在4℃－6℃冰箱内避光保存，移植前保藏期为2-3个月；移植培养，将虫草菌种转接到新配制的斜面固体培养基中，重复上述操作；

3)虫草菌种的接种

按照步骤1)中的液体培养基成分配制1000g液体培养基，装于带侧臂管的三角烧瓶内，灭菌冷却到室温后从斜面固体培养基中取出面积为1-3cm²的块状虫草菌苔，接入液体培养基中；

4)虫草菌种的摇床上培养

将步骤3中接入液体培养基中的虫草菌种，在24-26℃的恒温震荡培养箱中以转速为120-150r/min避光培养68-72h，期间pH控制在5.0-7.0；

5)虫草菌种的扩大发酵

将步骤1配制好的液体培养基倒入发酵罐，原位灭菌25-35min，降温后，迅速将步骤4中摇床上培养得到的虫草菌种培养液倒入发酵罐中，开始扩大发酵；设置发酵温度24℃～26℃，转速120-150r/min，培养8-12h后通气，通气量1.5-1.8v/v·min，避光培养1～2天，期间pH控制在5.0-7.0,制得活性虫草酵素发酵液。

2.如权利要求1所述的活性虫草酵素的制备方法，其特征在于，还包括步骤6)虫草酵素活性成分检测，

将上述步骤5)发酵后制得的活性虫草酵素发酵液置于离心机中，以3000-4500r/min的转速离心15-30min，收集发酵上清液，对发酵上清液用孔径为0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集发酵滤过液，再分别用基质固相分散提取法测定虫草素、分级沉淀法测定虫草SOD含量、苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量、乙醇-微波协同提取法测定虫草酸含量及基质固相分散提取法测定核苷类物质含量。

3.如权利要求1所述的活性虫草酵素的制备方法，其特征在于，所述液体培养基组成成分中碳源为葡萄糖、马铃薯其中之一；氮源为蛋白胨、胡萝卜、蚕蛹其中之一。

4.如权利要求1所述的活性虫草酵素的制备方法，其特征在于，所述透明质酸为3-10个双糖单位、分子量在1000-4000D的小分子透明质酸寡糖片段。

5.如权利要求1或3所述的活性虫草酵素的制备方法，其特征在于，所述液体培养基为：

葡萄糖10.0-20.0g，蛋白胨5.0-15.0g，透明质酸2.0-5.0g，K₂HPO₄ 0.4-1.0g，M_gSO₄·7H₂O 0.1-0.7g，VB1 0.02-0.05g，余下去离子水补到1000g。

6.如权利要求5所述的活性虫草酵素的制备方法，其特征在于，所述液体培养基组成成分中葡萄糖为20g，所述蛋白胨为15g，所述K₂HPO₄为1g，所述M_gSO₄·7H₂O为0.5g，所述VB1为0.05g，所述透明质酸为5g，余下去离子水补到1000g。

7.如权利要求1或2所述的活性虫草酵素的制备方法，其特征在于，所述菌种保藏中移植时间3个月，所述接种量取3cm²的块状虫草菌苔，所述步骤4中接入液体培养基中的虫草菌种摇床培养时间为72h，步骤5扩大发酵过程中所述虫草菌种扩大深层液体培养10h后通气，通气量为1.8v/v·min。