[发明专利]一种检测人葡萄膜黑色素瘤细胞的核酸适体

说明书

本发明公开了一种能够用于检测人葡萄膜黑色素瘤细胞（OCM‑1）的核酸适体及其在制备检测制剂中的应用。同现有的一些技术相比，本发明的优点在于：制备的核酸适体能特异性识别葡萄膜黑色素瘤细胞并具有较好的亲和力；无免疫原性；分子量小，能够体外化学合；可以对核酸适体的不同部位进行修饰和取代。同时，具有序列稳定，便于保存，方便标记等优势。采用本发明的核酸适体进行人葡萄膜黑色素瘤细胞检测时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好。

技术领域

本发明涉及一种核酸适体及其应用，特别是涉及一种可用于人葡萄膜黑色素瘤细胞及临床样本组织检测的核酸适体及其制备检测试剂的应用方法。

背景技术

葡萄膜恶性黑色素瘤(Uveal melanoma)是成年人中最常见的一种眼内恶性肿瘤，在国外其发病率占眼内肿瘤的首位，在国内则仅次于视网膜母细胞瘤，居眼内肿瘤的第二位。尽管在过去的几十年内葡萄膜黑色素瘤诊断及治疗有新进展，但其预后仍然很差，大约有31%的病人在诊断后5年内由于葡萄膜黑色素瘤而死亡，25年后将有半数的病人死亡。患者中常见转移，肝脏是最容易转移的部位。葡萄膜黑色素瘤患者10年累计转移率达34%。一旦发现转移，UM病人的平均生存期只有仅仅6到8个月因此，临床上迫切需要采取新的方法和手段诊断和治疗葡萄膜黑色素瘤患者，提高患者的生存期。

核酸适体（aptamer)是从人工合成的随机单链核酸库中筛选出来的能高亲和性结合靶分子的的寡聚核苷酸，包括DNA适体和RNA适体。适体因其结构的多样性而具有靶分子广、亲和力高、特异性强等特点。同时，相比传统抗体，适体分子量小、易改造修饰、制备方便且无免疫原性，因此，适体在基础研究、临床诊断、药物研制等方面展现了广阔的应用前景。利用这些适体对其所结合的细胞表面的靶分子进行表征和检测，有助于发现新的生物标志物，用于肿瘤的诊断。适体还可作为靶向配体与药物直接结合形成靶向药物传递体系，也可作为靶向基团修饰到药物载体表面，从而实现药物的靶向传递，为提高药物的临床疗效提供了一种可行的方法．同时，有些核酸适体本身也具有生物功能活性，能够抑制肿瘤细胞的增殖和转移，如AS1411。

发明内容

发明人利用核酸适体筛选技术（cell-SELEX），针对葡萄膜恶性黑色素瘤黑色素瘤细胞(OCM-1）进行筛选。所用的筛选初始文库总长度为61个碱基，包括两端固定的18个碱基的PCR引物序列，和中间25个碱基组成的随机序列。筛选过程中，前两轮只进行正向筛选，在第三轮开始加入负筛细胞，经过多轮的筛选，富集序列终于与葡萄膜黑色素瘤细胞有非常好的结合能力，同时特异性也非常强。之后将第7轮的富集序列进行了高通量测序，并对结果进行同源家族分析和比对之后，最终挑选出了核酸适体ZH-12。ZH-12表现出了与人葡萄膜黑色素瘤细胞的高亲和性以及特异性。在小鼠活体肿瘤实验中，尾静脉注射30分钟时后，在肿瘤位置既开始富集，60分钟时后富集信号达到最强，180分钟时后肿瘤位置仍有信号，表明该核酸适体在复杂环境中仍能保持良好的识别能力，并且保持高度的组织特异性。这表明该适配体适合进行人葡萄膜黑色素瘤细胞表征和检测，以及今后癌症靶标分子的寻找以及后续靶向治疗的应用。

本发明的目的提供一种高度特异性、稳定性、可用于人葡萄膜黑色素瘤细胞检测的核酸适体及在其制备检测试剂的应用方法。具体提供的技术方案如下：

一种检测人葡萄膜黑色素瘤细胞的核酸适体，包含如下序列：

5’-TATCGGGTTGGTAGGGGTTGGTTGA-3’，

其中5`端另有0至18任意一数值的核苷酸，3`端另有0至18任意一数值的核苷酸。优选地，其中5`端另有18个核苷酸，3`端另有18个核苷酸。

更优选为：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCATATCGGGTTGGTAGGGGTTGGTTGATGGACACGGTGGCTTAGT-3’，