[发明专利]一种家畜外周血来源巨噬细胞分离与培养的试剂盒

说明书

本发明公开了一种家畜外周血来源巨噬细胞分离与培养的试剂盒。本发明保护一种用于制备巨噬细胞的试剂盒，包括Hank's溶液、外周血淋巴细胞分离液和巨噬细胞培养液。本发明通过血液密度梯度离心法将颈静脉血、Hank，s溶液、人外周血淋巴细胞分离液(1:1:2均匀混合)的混合液离心，获得外周血单个核细胞，经体外分离培养7‑10天，从而获得巨噬细胞。实验证明，本发明试剂盒分离培养的巨噬细胞具有自发增殖和吞噬能力，可以经过20多次传代培养，分离培养的巨噬细胞与传统方法培育出的巨噬细胞在形态上一致；对巨噬细胞吞噬能力的鉴定与传统方法培育出的细胞差别不大，本发明试剂盒制备简单，成本低廉。

技术领域

本发明涉及一种家畜外周血来源巨噬细胞分离与培养的试剂盒。

背景技术

动物疫病的高发生率是当前畜牧业发展面临的重大挑战，据统计每年畜牧业总产值的12％至15％的损失是由畜禽疾病造成的。采用遗传学方法从遗传本质上提高动物机体免疫功能，增加动物对疾病的抗性具有治本的功效。随着细胞分子生物学的发展，通过对免疫细胞的免疫机制进行研究，加快了动物抗病育种工作的进程。

巨噬细胞作为哺乳动物机体重要的免疫细胞之一，参与固有免疫反应，对病原微生物有吞噬消化功能，具有抗原加工呈递作用，参与适应性免疫应答，在机体抵抗病原微生物入侵，衰老细胞清除，受损组织修复重建及促进炎症反应过程中均发挥关键的作用。巨噬细胞分离培养技术的建立为机体相关免疫反应研究及胞内菌感染机制提供了重要的细胞材料。

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。

发明内容

本发明的目的是提供一种家畜外周血来源巨噬细胞分离与培养的试剂盒。

本发明提供了一种制备巨噬细胞的方法，包括如下步骤：

(1)以离体外周血为出发材料，获得外周血单个核细胞；

(2)对步骤(1)得到的外周血单个核细胞进行培养，得到巨噬细胞。

所述步骤(2)中，采用巨噬细胞培养基对步骤(1)得到的外周血单个核细胞进行培养。

本发明还保护一种制备巨噬细胞的方法，包括如下步骤：

(a)将离体外周血、Hank's溶液和外周血淋巴细胞分离液混合，收集外周血单个核细胞；

(b)采用巨噬细胞培养液培养步骤(a)得到的外周血单个核细胞，得到巨噬细胞。

所述步骤(a)中，所述离体外周血、Hank's溶液和外周血淋巴细胞分离液的体积配比为1:1:2。

所述步骤(a)具体包括如下步骤：(1)将1体积份离体外周血和1体积份Hank's溶液均匀混合，得到混合溶液；(2)将1体积份步骤(1)得到的混合溶液加至1体积份外周血淋巴细胞分离液上面，分离得到外周血单个核细胞。

所述步骤(2)具体包括如下步骤：(I)将1体积份步骤(1)得到的混合溶液加至1体积份外周血淋巴细胞分离液上面，离心，将中间白色雾状层细胞转移至离心管中，离心，收集沉淀；(Ⅱ)采用Hank's溶液洗涤步骤(I)得到的沉淀(具体可为两次)，离心，收集沉淀(即外周血单个核细胞)。

所述步骤(b)具体包括如下步骤：采用巨噬细胞培养液培养所述外周血单个核细胞24h，弃去悬浮细胞，PBS溶液洗涤贴壁细胞(具体可洗涤两遍)，在巨噬细胞培养液中培养，每隔3-4天更换新的巨噬细胞培养液，连续培养7-10天，得到巨噬细胞。

本发明还保护以上任一所述的方法制备得到的巨噬细胞。

本发明还保护一种用于制备巨噬细胞的试剂盒，包括Hank's溶液、外周血淋巴细胞分离液和巨噬细胞培养液。