[发明专利]一种检测土壤中带羟基的脂肪酸甲酯类的方法

说明书

技术领域

本发明涉及化学领域，尤其涉及化合物检测技术，特别涉及气相色谱质谱联用检测化合物的方法，具体来说是一种检测土壤中带羟基的脂肪酸甲酯类的方法。

背景技术

磷脂脂肪酸(PLFA)是微生物细胞膜的主要成分，是甘油的第三位羟基被磷酸酯化、其它羟基被脂肪酸酯化而成，其磷酸基部分称为极性头部，两条长碳链称为非极性尾部。磷脂脂肪酸是构成活体细胞膜的重要组分，是磷脂的构成成分，它具有结构多样性和生物特异性，土壤中PLFA的存在及其丰度可揭示生物或生物种群的存在及其丰度，磷脂在细胞死亡后快速降解，故以表征微生物群落中“存活”的那部分群体，因此磷脂脂肪酸分析法被广泛应用于环境样品中微生物群落结构变化的分析。

经提取得到的PLFA的分析方法经历了不断完善的过程，从气色谱法、液相色谱发、到目前的PLFA分析测定基本上都采用准确、方便和快捷的气相色谱质谱联用技术(GC-MS)。各种参数对分离效果均有影响，选择柱温时要综合考虑多方面因素：进样口温度必须足够高，以便迅速蒸发待测样品，而不使效率因注射技术而受到损失，另外，该温度又必须足够低以避免热分解和重排，温度对检测器的影响很大程度上取决于所用检测器的类型，一般检测器的温度应该足够高，以不使样品发生冷凝。目前研究阶段提取方法较为成熟，但是针对气相色谱质谱联用分析方法中各参数设置不尽合理，特别是针对带羟基的脂肪酸甲酯类。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测土壤中带羟基的脂肪酸甲酯类的方法，所述的这种检测土壤中带羟基的脂肪酸甲酯类的方法要解决现有技术的检测方法不能确保所有种类的磷脂脂肪酸能被精准有效的定性定量的分析检测的技术问题。

本发明提供了一种检测土壤中带羟基的脂肪酸甲酯类的方法，包括如下步骤：

1)一个采用Bligh-Dyer提取法对土壤中的磷脂脂肪酸进行提取的步骤；提取后的磷脂脂肪酸通过SPE硅胶小柱分离得到磷脂层，在碱性条件下将磷脂脂肪酸水解形成脂肪酸甲酯，获得待气质联用仪分析的样品；

2)采用气相色谱-质谱联用仪对脂肪酸甲酯进行分析；先采用HP-INNOWAX色谱柱对带羟基的脂肪酸甲酯类进行分离，然后通过质谱分析获得检测土壤样品中带羟基的磷脂脂肪酸的含量。

进一步的，所述的采用Bligh-Dyer提取法对土壤中的磷脂脂肪酸进行提取的步骤包括如下过程：

1)称取新鲜土壤至蒸发皿中，放入100～110℃烘箱，烘干至土壤中水分完全蒸干，称量烘干后质量，从而测得土壤含水量，

2)称取2g新鲜土壤至20ml离心管内，加入11.9ml CM溶液，加入CB溶液使管内样品含水量加至3.16ml，需加入的CB溶液体积计算方式如下：

所述的CM溶液为含质量百分比浓度为0.005％的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的氯仿甲醇溶液，氯仿和甲醇的体积比为1：2，所述的CB溶液为pH＝4的柠檬酸钠缓冲溶液；

3)将样品经涡旋震荡后超声20～50min，放入1～6℃冰箱中过夜；

4)将步骤3)的样品摇晃后放入离心机中以1000～1200转/min的转速离心，上层清液转移到干净的容器中，向移去上层清液的下层土壤泥浆样品的离心管内加入5ml BD溶液，摇匀后放入离心机中以1000～1200转/min的转速离心，取上层清液，再向移去上层清液的下层土壤泥浆样品的离心管内加入5ml BD溶液，所述的BD溶液为含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚质量百分比浓度为0.005％的氯仿甲醇以及柠檬酸钠缓冲溶液的混合溶液，在所述的混合溶液中，氯仿、甲醇以及柠檬酸钠缓冲溶液的体积比为1：2：0.8，再次摇匀后放入离心机中以1000～1200转/min的转速离心10min，取上层清液，将以上这三次离心后的上层清液转移至上述的干净的容器中，在上述的干净的容器中加入4ml三氯甲烷和4ml CB溶液，分相后，将烧瓶放入1～6℃冰箱中过夜；

5)将下层溶液在40～55℃下用氮气吹干，吹干后的残渣为土壤经过提取后的脂质层；所述的残渣中含中性脂肪、糖酯、磷酯；

6)依次向固相萃取柱内加入2ml甲醇，2ml丙酮，2ml三氯甲烷将萃取柱进行活化；

7)将之前用氮气吹干的下层溶液残渣用300uL的三氯甲烷复溶并加到萃取柱内，后向柱内依次加入5ml三氯甲烷，12ml丙酮，舍弃流出液，再加入8ml甲醇，收集流出液，将收集出的流出液在40～55℃下用氮气吹干，-20℃冷冻备用；