[发明专利]一种检测土壤中带羟基的脂肪酸甲酯类的方法

权利要求书

1.一种检测土壤中带羟基的脂肪酸甲酯类的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)一个采用Bligh-Dyer提取法对土壤中的磷脂脂肪酸进行提取的步骤；提取后的磷脂脂肪酸通过SPE硅胶小柱分离得到磷脂层，在碱性条件下将磷脂脂肪酸水解形成脂肪酸甲酯，获得待气质联用仪分析的样品；

2)采用气相色谱-质谱联用仪对脂肪酸甲酯进行分析；先采用HP-INNOWAX色谱柱对带羟基的脂肪酸甲酯类进行分离，然后通过质谱分析获得检测土壤样品中带羟基的磷脂脂肪酸的含量。

2.根据权利要求1所述的一种检测土壤中带羟基的脂肪酸甲酯类的方法，其特征在于：所述的采用Bligh-Dyer提取法对土壤中的磷脂脂肪酸进行提取的步骤包括如下过程：

1)称取新鲜土壤至蒸发皿中，放入100～110℃烘箱，烘干至土壤中水分完全蒸干，称量烘干后质量，从而测得土壤含水量，

2)称取2g新鲜土壤至20ml离心管内，加入11.9ml CM溶液，加入CB溶液使管内样品含水量加至3.16ml，需加入的CB溶液体积计算方式如下描述：

所述的CM溶液为含质量百分比浓度为0.005％的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的氯仿甲醇溶液，氯仿和甲醇的体积比为1：2，所述的CB溶液为pH＝4的柠檬酸钠缓冲溶液；

3)将样品经涡旋震荡后超声20～50min，放入1～6℃冰箱中过夜；

4)将步骤3)获得的样品摇晃后放入离心机中以1000～1200转/min的转速离心，上层清液转移到干净的烧瓶中，向移去上层清液的下层土壤泥浆样品的离心管内加入5ml BD溶液，摇匀后放入离心机中以1000～1200转/min的转速离心，取上层清液移入上述干净的烧瓶中，再向移去上层清液的下层土壤泥浆样品的离心管内加入5ml BD溶液，所述的BD溶液为含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚质量百分比浓度为0.005％的氯仿甲醇以及柠檬酸钠缓冲溶液的混合溶液，在所述的混合溶液中，氯仿、甲醇以及柠檬酸钠缓冲溶液的体积比为1：2：0.8，再次摇匀后放入离心机中以1000～1200转/min的转速离心10min，取上层清液，将以上这三次离心后的上层清液转移至上述的干净的烧瓶中，在上述的干净的烧瓶中加入4ml三氯甲烷和4ml CB溶液，分相后，将烧瓶放入1～6℃冰箱中过夜；

5)将下层溶液在40～55℃下用氮气吹干，吹干后的残渣为土壤经过提取后的脂质层；

6)依次向固相萃取柱内加入2ml甲醇，2ml丙酮，2ml三氯甲烷将萃取柱进行活化；

7)将之前用氮气吹干的下层溶液残渣用300uL的三氯甲烷复溶并加到萃取柱内，后向柱内依次加入5ml三氯甲烷，12ml丙酮，舍弃流出液，再加入8ml甲醇，收集流出液，将收集出的流出液在40～55℃下用氮气吹干，-20℃冷冻备用；

8)将吹干后的残渣用0.5ml无水甲醇，0.5ml甲苯，1ml氢氧化钾甲醇溶液复溶，加入磁子后放到磁力加热搅拌器上37℃水浴加热30min；

9)向步骤8)的溶液中加入0.3ml乙酸溶液，5ml SE溶剂以及3ml蒸馏水，将衍生化反应停止，摇晃后放入超声波清洗器中清洗30min，以1000～1200转/min的转速离心5min；所述的SE溶剂为正己烷和氯仿组成的混合溶剂，正己烷和氯仿的体积比为是4：1；

10)在上述离心后的上层溶液中加入3ml氢氧化钠溶液，所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.3mol/l，晃30s后以1200转/min的转速离心15min，上层清液过滤后转移到干净、带标签的样品瓶中；

11)未转移的下层水相继续用3ml的SE溶剂清洗，以1200转/min的转速离心5min，将上层清液过滤后转移到上述带标签的样品瓶中；

12)重复上述步骤11)，将所有离心后得到的上层清液都收集到样品瓶后，在40℃下用氮气吹干，将吹干后的残渣保存在-20℃冰箱中，用于后续的气相色谱分析。