[发明专利]改进空隙及孔隙促进细胞黏附率的复合支架及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于复合支架技术领域，尤其涉及一种改进空隙及孔隙促进细胞黏附率的复合支架及制备方法。

背景技术

骨缺损是骨科临床上常见的问题，每年全世界多达有220万人因外伤、感染、肿瘤等原因而需要骨移植治疗，而在美国，每年需植骨的病人中大约60％采用自体骨移植，34％采用异体骨移植，仅7％的病人采用其它植骨材料。对于外伤，骨肿瘤等各种骨病所引起的骨不连和骨缺损，通常是应用自体或者是同种异体的骨移植来治疗。这些方法虽然也很有效，但仍经常遇到材料来源不足，供体疾病的传染风险，移植材料的塑性困难等。人工植入物由人工合成制备，可以不受供源限制，又由于它是惰性物质，所以避免免疫排斥，然而人工植入物在功能上无法完全替代生物组织与器官，而且有时也会产生异物反应。因此，至今临床上还没有一个完美的方法可以完全解决受损组织和器官的修复问题。因此一定程度上促成了组织工程疗法的快速发展。组织工程化器官将比供体器官更易于获得，由组织工程再造的组织和器官不但可以同人工替代物一样进行大批量的生产，而且这样的组织和器官同天然的组织和器官具有相同的功能，还可防止免疫排斥的产生，被认为是最有希望彻底解决组织和器官修复难题的途径。自1995年来骨组织工程由Crane等提出后取得了长足的发展，作为组织工程研究的重要领域，骨组织工程研究在多个方面均取得了令人振奋的研究成果，并已在临床得到初步应用，被认为是组织工程中最具有前途和可行性的领域之一。目前最有希望在临床广泛使用的骨组织工程种子细胞是骨髓基质干细胞。它具有来源方便，取材简单，对患者的损伤小等优势。BMSCs具有自我更新的能力并且能够多向分化，这是干细胞的共性。已有大量研究证实无论是在裸鼠等、鼠小动物，还是山羊等大动物的体内，BMSCs作为种子细胞都能够有效的形成组织工程骨并成功修复各个部位的骨缺损而且有研究表明成人BMSCs在适宜的诱导条件下也能够表现成骨细胞的形态和功能，并且在裸鼠体内形成组织工程骨，在目前使用BMSCs也取得了相应的良好的疗效也常见诸报端。随着近些年骨组织工程的快速发展，支架材料的选择和制备成为了研究的热点，理想的骨组织工程支架材料应满足以下几点：1、生物相容性高：除如无毒、不致畸等满足生物材料的一般要求之外，还要有降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应并且利于种子细胞的粘附、增殖，对于细胞的生长和分化有促进作用；2、生物降解性适合：支架材料应具有降解功能，骨组织细胞生长速率应与降解速率相适应；3、具有合适的三维立体多孔结构：支架材料应具有三维立体结构，相应的孔隙率，比表面积高，能够为成骨性细胞的黏附、增殖、生长和功能的发挥提供一个最佳的微环境，同时也能够为新骨组织的形成提供空间和支架；4、可塑性和适合的机械强度：支架材料具有良好的可塑性和适合的机械强度，能够支撑新生组织，并直至新生组织具有适当力学特性；5、良好的支架-细胞界面：材料应提供良好的支架-细胞作用界面，利于细胞粘附。生物陶瓷是一种晶体材料，是由金属离子及非金属离子以离子键结合的。根据生物陶瓷在生理环境中的化学活性可分为四类：惰性生物陶瓷、表面活性生物陶瓷、可吸收生物陶瓷及复合生物陶瓷。硫酸钙陶瓷、碳酸钙陶瓷、磷酸钙陶瓷及其同分异构体都属于可降解生物陶瓷。硫酸钙因无骨诱导作用，脆性大所以应用较少。Cheroff从珊瑚中提取碳酸钙陶瓷并于犬的股骨、胫骨骨缺损模型修复中应用。目前广泛应用的骨替代材料之一是以羟基磷灰石为代表的磷酸钙盐陶瓷，它们的骨传导性能都非常好。因为羟基磷灰石的脆性较大且不易被吸收等这些缺点均限制了其在承重部位的应用。生物衍生骨是这样的一类生物材料。它是用人或动物的骨组织经过一系列方法处理后，将其细胞成分和抗原性去掉，完全或部分保存原来组织网架结构。在国际上已有生物衍生骨材料的产品应用于临床，如Oswestry骨、Bio-Oss、Kiel骨骨等，并且在临床上取得了良好的疗效。李彦林等应用猪的肋骨制备成部分脱钙骨、完全脱蛋白骨、部分脱蛋白骨三种材料，而且测定了这三种的衍生骨性能。通过电镜观察表明，有原骨组织的网状孔隙结构系统是这三种材料的共性，但它们又各具特点：完全脱蛋白骨(即煅烧骨)的抗原性是三种里最小的，有良好的成骨效果，能够在临床应用并且取得一定的疗效，但机械强度差，有待改进；部分脱蛋白骨具有弱抗原性，其机械强度尚可，但成骨效果不理想；脱钙骨抗原性是三种里最强的，影响成骨，基本无法单独应用。广泛存在于虾、蟹、昆虫等动物的甲壳中的甲壳质脱乙酰后即为壳聚糖，在天然有机化合物中，其数量在自然界仅次于纤维素。壳聚糖是一种新型天然医用生物材料，无毒、有良好的生物相容性，并且其在体内分解后产物可直接代谢并对人体无害。壳聚糖能引导或促进骨的形成有一定的骨传导性。壳聚糖是无抗原性能够诱导细胞增殖并且可以促进植入体与宿主组织一体化。Klokkevold等研究了壳聚糖对体外成骨细胞分化和骨形成的影响，实验结果表明，壳聚糖可以促进前期骨细胞分化，加速骨形成的作用。脱去乙酰基的链节数占所有链节数的百分比为壳聚糖脱乙酰度。壳聚糖脱乙酰度影响着壳聚糖的溶解性能，而且直接决定其分子链上氨基(NH2)含量的多少，因为当其脱乙酰度为50％时，壳聚糖可以获得最佳的溶解性。根据脱乙酰度不同，壳聚糖的pH值在6.5-7.3之间，在壳聚糖中氨基被质子化后，壳聚糖溶液行为表现为弱的聚阳离子电解质。壳聚糖上的氨基和羟基是具有反应活性的基团，因此可以通过化学改性使之具有新功能，如在壳聚糖分子结构进行醋化以增加其溶解性。壳聚糖还有一种特性就是抑菌，它能够抑制细菌的生长和降低其活性。然而必须指出的是不同壳聚糖的种类，以及分子量，并且浓度等一些条件对其抗菌的效果均有影响。壳聚糖无论何种生物材料其生物相容性是首先必须要评估的。Vandevord等采用异位成骨法来评定的，他首先将冷冻干燥CS溶液法制备出的多孔支架材料切成边长为1.5cm正方体小块消毒后在PBS中清洗，然后植入老鼠背部和腹部。分别在一定的时间点上观察炎症反应，组织学评价和细胞免疫学反应。最后发现支架材料在体内没有发生炎症反应；在HE染色中发现有嗜中性细胞聚集在支架材料周围，但是当植入时间延长这些嗜中性细胞便逐渐消失，而且发现有胶原在支架孔中生成，说明在最初植入时支架材料有非常低的细胞免疫反应，或者是手术造成的应激反应。这些都说明CS支架具有较高的生物相容性，在生物相容性这点上可以作为支架材料和植入材料进行应用。有人用电纺丝方法制备了具有一定结构的CS支架，并在其上面种植了新西兰白兔关节部位截取的软骨细胞共同培养，最后发现支架可以很容易的与软骨细胞形成紧密结合。壳聚糖在生物体内是如何降解的目前还有很多争议，但较多的学者认为壳聚糖主要是依靠体内环境中的酶降解，如果在中性的水介质中CS的降解较慢。在体内壳聚糖可以很容易的被溶菌酶等酶类降解，其体内降解最终产物氨基葡萄糖，可以完全被人体吸收无毒。壳聚糖能够对机体细胞产生影响是通过粘附、激活和促进及抑制等来作用的。壳聚糖的细胞粘附作用在文献报道中出现较多，其中对成骨细胞和成纤细胞的粘附作用占主要部分。壳聚糖及其衍生物可以抑制微生物生长、止血、止痛、并且能够促进或抑制成纤维细胞增殖、迁移、生长、激活和趋化巨噬细胞、诱导有序的胶原沉积和纤维排列、有利于新生组织的结构重塑和构建等活性，决定了其在组织工程中有重要应用。壳聚糖能够对机体细胞产生影响是通过粘附、激活和促进及抑制等来作用的。壳聚糖的细胞粘附作用在文献报道中出现较多，其中对成骨细胞和成纤细胞的粘附作用占主要部分。组织工程的发展对生物材料提出了新要求。研制出具有能产生所期望的宿主反应的能力的生物材料才是追求的目标，从材料表面所发生的蛋白质吸附、免疫反应、细胞因子和生长因子的释放、目标细胞的反应着手，诱发期望的愈合途径，使组织重建。高细胞亲和性组织工程支架是今后生物材料的主要发展方向。