[发明专利]蛇胆汁的超高效液相色谱-串联质谱鉴别方法

权利要求书

1.蛇胆汁的超高效液相色谱-串联质谱鉴别方法，其特征在于，鉴别方法包括如下：

（1）样品收集：分别收集原蛇胆汁、生产企业投料的蛇胆汁及其他动物胆汁；

（2）对原蛇胆汁进行物质基础研究并对原蛇胆汁及其它动物胆汁的特征成分进行确证；拟定当待测蛇胆汁样品中能同时检出牛磺胆酸硫酸酯和牛磺去氧胆酸硫酸酯时，认为该样品为符合要求的蛇胆汁；

（3）对照药材溶液的制备：取蛇胆汁对照药材约10mg，精密称定，加50%甲醇10mL，超声处理10min，超声处理条件：功率320W、频率40kHz，过0.22μm滤膜，即得；

（4）生产企业投料的蛇胆汁的制备：取样品，混匀，精密吸取20μL，置2mL离心管中，精密加入50%甲醇950μL，摇匀，过0.22μm滤膜，即得；

（5）液相条件：色谱柱：EcLipse PLus C18柱，柱温35℃，流速0.3mL/min，以甲醇-10mmoL/L乙酸铵溶液体系，进行梯度洗脱，洗脱过程：0～10min，40%→50%甲醇，10～25min，50%→80%甲醇；

（6）质谱条件：采用电喷雾电离源（ESI），负离子方式扫描，MRM方式检测；干燥气温度：200℃；干燥气流速：12L/min；雾化气压力：20psi；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：11L/min；离子漏斗参数：高压150V，低压60V；毛细管电压：3KV；喷嘴电压：1000V；

（7）样品测定：分别精密吸取上述蛇胆汁对照药材溶液、生产企业投料的蛇胆汁各1μL，进样分析；

所述原蛇胆汁由活蛇取胆，用50%乙醇1:1浸泡得到；

所述其它动物为鸡、鸭、牛、羊、猪和狗；所述其他动物胆汁由活物取胆，用50%乙醇1:1浸泡得到；

所述对原蛇胆汁进行物质基础研究是：采用超高效液相-四级杆/飞行时间质谱技术，用负离子模式进行采集，对蛇胆汁的物质基础进行研究；确定牛磺胆酸为蛇胆汁的主要成分；

所述对原蛇胆汁及其它动物胆汁的特征成分进行确证步骤如下：

1）对照品溶液的制备：精密称取牛磺胆酸、甘氨去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺石胆酸对照品各10mg，分别置20mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各对照品贮备液；分别精密吸取上述贮备液各2μL，加50%甲醇998μL，摇匀，即得；

2）对照药材溶液的制备：取蛇胆汁对照药材约10mg，精密称定，加50%甲醇10mL，超声处理10min，超声处理条件：功率320W、频率40kHz，过0.22μm滤膜，即得；

3）原蛇胆汁及其它动物胆汁的制备：分别取各个样品，混匀，精密吸取50μL，置2mL离心管中，精密加入50%甲醇950μL，摇匀，过0.22μm滤膜，即得；

4）按以下色谱条件试验得到原蛇胆汁及其他动物胆汁的基峰离子流图；通过Bruker的ProfiLeanaLysis，进行数据分析，得到蛇胆汁专属性特征离子m/z578.247和m/z 594.241，其它各动物胆汁均未含有；

液相条件：色谱柱：Thermo AccLaimTM RSLC 120 C18柱，规格为：2.1×100mm，2.2μm，120Å；柱温35℃，流速0.3mL/min，以甲醇为流动相A，以10mmoL/L乙酸铵为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序：0～5min，30%→50%A，5～20min，50%→90%A，20～25min，90%A，25～26min，90%→30%A，30min，30%A；

质谱条件：采用电喷雾电离源（ESI），负离子方式扫描；干燥气温度：220℃；干燥气流速：8L/min；雾化气压力：2bar；毛细管电压：3500V；喷嘴电压：500V；校正液：甲酸钠溶液；扫描范围：50～1000；Spectra rate:1HZ。