[发明专利]犬冠状病毒抗体快速定量检测卡及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测卡，特别是涉及一种犬冠状病毒抗体快速定量检测卡及使用方法。

背景技术

犬冠状病毒（Canine Coronavirus，CCV）属冠状病毒科冠状病毒属成员。病毒具有冠状病毒的确一般形态特征，呈圆形或椭圆形，长径80～120nm，宽径为75～80nm，有囊膜，囊膜表面有花瓣状纤突，长约20nm，冻融极易脱落，是去感染性。核衣壳呈螺旋状。病毒基因型为单股RNA。其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，只感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。

犬冠状病毒有四种结构蛋白，分别为纤突糖蛋白（S，Spike Protein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点）；小包膜糖蛋白（E，Envelope Protein，较小，与包膜结合的蛋白）；跨膜糖蛋白（M，Transmembrane Protein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成）。核蛋白（N蛋白，Nucleocapsid Protein）与病毒的RNA紧密结合而成病毒的核心壳，呈螺旋状，直径9～16nm。

各种年龄、品种和性别的犬均易感染，但2～4月龄犬发病率最高，出生后2～3天的幼犬常迅速成窝死亡。本病一年四季均可发生，但冬季多发，该病的发生和严重程度常与断乳、运输、气温骤变、饲养条件恶化以及年龄、应激或其他病原混合感染等直接或间接有关。近年对犬冠状病毒的研究发现其宿主范围较广，除犬外，猫、猪、狼、大熊猫、狐狸等均可感染。

犬冠状病毒的防控主要是疫苗免疫，而疫苗免疫动物与感染动物体内都会产生结构蛋白抗体，因此检测结构蛋白抗体的诊断方法能确定动物对病毒株的抵抗力。同时日常监测疫苗产生抗体是对群体的日常监测选择疫苗、评估免疫程序合理性、掌握犬健康状态的重要手段，同时也可从侧面反映管理是否合理，也是适时注射疫苗的主要依据。

市场上大量使用检测犬冠状病毒抗体酶标试剂盒，ELISA试剂盒需要酶标仪、温育反应条件、洗板条件，操作工作环境和专业技术人员，另外检测样本还需要复杂的前处理，如采集血液，分离血清等；而快速胶体金虽然检测方便，不需专业技术人员和工作环境，但其检测的灵敏度低，且只能定性，检测范围窄。而本发明专利的目的就是克服以上两类试剂盒的各自缺点，通过简单的操作，现场快速、准确、高灵敏地定量（半定量）分析，实现在宠物饲养现场检测。

发明内容

本发明的目的就是提供一种犬冠状病毒抗体快速定量检测卡及使用方法，克服胶体金快速检测卡和酶标试剂盒各自缺点，通过简单的操作，实现在现场快速、准确、高灵敏地定量检测，从而完全解决上述现有技术的不足之处。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种犬冠状病毒抗体快速定量检测卡，包括检测卡外壳和装配在检测卡外壳内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板，在底板上依次粘贴样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述标记物垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上包被犬冠状病毒重组抗原为检测线，包被兔抗鸡lgY抗体为质控线，标记物为标记有犬冠状病毒结构蛋白S的重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgY抗体的荧光质控微球。

进一步，所述犬冠状病毒重组抗原是犬冠状病毒结构蛋白S蛋白，其为多表位表达的重组蛋白。

进一步，所述硝酸纤维素膜上质控线采用的兔抗鸡lgY抗体为兔抗鸡lgY的lgG。一种制备上述犬冠状病毒结构蛋白的方法，采用生物信息学技术（Bioinformatics）对犬冠状病毒不同亚型毒株的S基因进行比对，确认犬冠状病毒S蛋白基因序列，设计一对引物，经PCR扩增出目的S基因，将S基因连接到真核表达载体pEGFP-C1上，构建出重组质粒pEGFP-S，之后进行双酶切鉴定。利用Lipofecta mine 2000（脂质体2000转染试剂）转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中，通过G418筛选后，在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光，这表明重组融合蛋白pEGFP-S在PK-15细胞中得到了表达。将能够表达重组融合蛋白的细胞克隆，进一步大量表达并纯化犬冠状病毒结构蛋白S蛋白。

一种制备上述犬冠状病毒结构蛋白的方法，采用生物信息学技术原理，应用计算机对犬冠状病毒的结构蛋白S抗原基因进行比对分析，及抗原表位预测，筛选和设计犬冠状病毒结构蛋白特异性的抗原肽序列，并进行人工化学合成抗原肽。