[发明专利]一种诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成破骨样细胞的方法

权利要求书

1.一种诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成破骨样细胞的方法，其特征在于：在大鼠骨髓间充质干细胞培养基中添加硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)，利用硫代乙酰胺作用于培养的大鼠骨髓间充质干细胞，诱导其定向分化为破骨样细胞。

2.根据权利要求1中的方法，其特征在于，大鼠骨髓间充质干细胞的制备：无菌条件下分离出大鼠乳鼠双下肢股骨，用含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液冲洗骨髓腔，收集单细胞悬液，离心，弃上清液，用10％胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬，取约5×10³个细胞接种在培养瓶中，置于37℃、体积分数5％CO₂的培养箱中培养，48h后首次全量换液，以后每2至3天换液，10至12天后细胞融合70％～80％，0.25％胰酶消化后以1∶3传代培养。

3.根据权利要求1至2的方法，其特征在于，制备的大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定方法，即采用流式细胞法检测骨髓间充质干细胞表面阳性标志物CD90和CD29，采用流式细胞法检测骨髓间充质干细胞表面阴性标志物CD45和CD11b/c，所使用的为第3代大鼠骨髓间充质干细胞，且阳性细胞比例≥95％，阴性细胞比例＜6％。

4.根据权利要求1至3的方法，其特征在于，诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成破骨样细胞的诱导培养基中所含的水溶性硫代乙酰胺(TAA)含量为0.5mg/ml和1.0mg/ml，基础培养基为DMEM/F12培养液，同时添加体积分数为10％的胎牛血清。

5.根据权利要求1至4的方法，其特征在于，诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成破骨样细胞方法中大鼠骨髓间充质干细胞为第3代大鼠骨髓间充质干细胞，诱导培养基诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成破骨样细胞的时间为3天和7天。

6.根据权利要求1至5的方法，其特征在于，水溶性硫代乙酰胺(TAA)诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成的破骨样细胞的鉴定方法，即抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)法鉴定破骨样细胞、Western blot法鉴定破骨细胞特异性蛋白抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和组织蛋白酶K(Cathepsin K)蛋白表达以及电化学发光法检测骨代谢标志物：N端骨钙素(ng/ml)，甲状旁腺激素(pg/ml)，维生素D(ng/ml)。

7.根据权利要求1至6的方法，其特征在于，水溶性硫代乙酰胺(TAA)诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成的破骨样细胞的鉴定结果：抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)法鉴定结果显示，诱导组可以观察到更多的trap染色阳性细胞，即破骨样细胞，细胞体积更大，可看到多于3个细胞核的细胞；Western Blot法鉴定结果显示，破骨细胞特异性蛋白抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和组织蛋白酶K(Cathepsin K)蛋白表达水平呈上升趋势，说明破骨细胞生成量增加；电化学发光法检测骨代谢标志物鉴定结果显示，溶骨相关和骨转换相关骨标志物水平的变化说明破骨细胞活性增强。

8.根据权利要求1至7的方法，其所诉的诱导破骨样细胞形成方法用于在提高大鼠骨髓间充质干细胞向破骨样细胞分化方面的应用。

9.根据权利要求1至7的方法，其所诉的诱导破骨样细胞形成方法用于在建立一种新型体外破骨细胞培养体系方面的应用。

10.根据权利要求1至7的方法，其所诉的诱导破骨样细胞形成方法用于在建立骨与关节病变细胞模型方面的应用。

11.根据权利要求1至7的方法，其所诉的诱导破骨样细胞形成方法用于在建立抗骨质疏松症药物筛选平台方面的应用。

12.根据权利要求1至7的方法，其所诉的诱导破骨样细胞形成方法用于在建立抗骨质破坏症药物筛选平台方面的应用。