[发明专利]一种骨髓干细胞诱导分化为心肌细胞的方法

说明书

一种骨髓干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，骨髓间充质干细胞（MSCs），体外培养诱导MSCs分化成为心肌细胞，体外培养中将骨髓间充质细胞经2次细胞传代后，以5氮胞苷进行24h诱导，于7～11d后得到长的多核肌管，而且此肌管对骨骼肌细胞特异性肌球蛋白单克隆抗体染色为阳性，从而确定MSCs可以于体外诱导成为骨骼肌细胞。用大鼠MSCs在体外连续传代培养，暴露于5氮胞苷中，结果成功地诱导出心肌细胞。在小鼠胚胎细胞系向心肌细胞分化的研究中，这类细胞含有肌细胞源性决定族，在甲基化状态呈现转录失活，而在5氮胞苷作用下，即去甲基状态下，肌细胞决定族转录激活，从而使该类细胞分化为心肌细胞，体内心肌微环境下诱导MSCs分化为心肌细胞。

技术领域

本发明涉及一种骨髓干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，具体地说是以一种骨髓干细胞诱导分化为心肌细胞的方法。

背景技术

目前公知的心肌梗塞后存活的心肌减少、继发心室重构，是造成心肌梗塞患者发生心力衰竭(心衰)、心律失常甚至死亡的重要原因。心肌细胞不能再生，损害的心肌细胞不能修复和分化，故临床中西药物治疗、介入治疗和手术治疗都很难取效，而心脏移植由于手术复杂、供体困难和费用高等原因，在临床很难推广。因此，寻找可代替死亡细胞的移植物来防治心肌梗塞后的心衰、心肌重构，改善心功能，是近年来研究的热点。

发明内容

诊断标准：研究对象：MSCs属于非造血细胞，其基本特点是贴壁生长，呈纺锤状的纤维细胞样形态，具有巨大的培养增殖潜力和独特的细胞表型，并呈现为表面抗体SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124和CD166阳性，CD14、CD34、CD45阴性。MSCs在培养过程中经过连续多代培养，仍能维持正常染色质组成及端粒活性，因而具有很大的体外培养扩增能力。Reyes 等研究认为MSCs具有独特的表型和巨大的培养增殖能力，细胞可以扩增到15～70倍细胞周期； Guo等的研究提示多种细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNFα），干扰素γ（INFγ），干细胞因子（SCF）及胰岛素样生长因子1（IGF1）能明显促进MSCs增殖；细胞化学结果显示，几乎所有MSCs呈萘酚醋酸酯酶（ANAE）及糖原（PAS）反应阳性，而呈酸性磷酸酶（ACP）及苏丹黑（SB）反应阴性。Biano等采用体外培养和体内移植发现骨髓间充质细胞的存在；他们在体外培养MSCs时发现，在低密度培养时，每个细胞很快贴壁生长并形成克隆的、非巨噬细胞性的、成纤维细胞样的细胞系，在合适的实验条件下可分化为多种结缔组织，如骨、软骨、脂肪组织、纤维组织和骨髓支持基质等；体内移植实验发现一部分克隆细胞系可以完全建立骨髓间充质，形成骨细胞、骨髓支持基质和脂肪细胞，说明MSCs是多向分化潜能的干细胞而非定向分化的祖细胞。Weissman认为MSCs不但能大量增殖，而且在一定条件下可以分化为骨、软骨、肌腱、肌肉、神经和造血微环境组织等，表明MSCs 有很高的可塑性。

结果：采用中药有效成分作为诱导剂对MSCs进行诱导分化，这不仅为应用中医药治疗心肌梗塞提供新的理论依据，而且有可能与细胞移植的方法相结合治疗某些心血管疾病。

发明目的：近年的研究发现，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我更新、分化增殖和多向分化潜能的特点，在一定的环境和刺激因子作用下可分化为组织细胞，如成肌细胞（包括心肌细胞）、骨细胞、软骨细胞、神经细胞及脂肪细胞等，且在体外培养的过程中能始终保持其多向分化潜能。在组织工程中，MSCs作为一种重要的种子细胞越来越引起人们的关注。将MSCs诱导分化为心肌细胞来修复死亡的心肌组织，具有一定的临床意义。本文就目前体内外诱导MSCs成为心肌细胞的研究状况进行综述，并对中医药在此领域的应用前景作一展望。