[发明专利]参与植株侧生器官及花发育的白桦SEP1基因及其蛋白

说明书

技术领域：本发明涉及一个参与植株侧生器官建成及花发育的白桦BpSEP1基因及其蛋白,属于分子生物学中的基因技术领域。

背景技术：

通过对拟南芥(Arabidopsis thaliala)、矮牵牛(Petunia hvbrida)和金鱼草(Antirrhinum majus)等模式植物的研究，人们提出了花器官发育的ABC模型，即控制花结构的基因(绝大多数为MADS盒基因)按功能可划分为ABC三大类，同一组基因控制相邻2轮器官的发育；同时指出A、C组基因互相抑制，其表达受到花序分生组织特异基因的上位调节；B组基因以自主调节方式控制自身的表达，它与A、C组基因的表达相互独立；C组基因通过与其它基因的相互作用调节其在4轮花器官结构中的时空表达。随着研究的深入，人们在寻找与ABC类基因相互作用的蛋白时发现了花器官发育的E类基因-SEPALLATA(SEP)基因。该基因在花器官发育中不可或缺，参与整个花分生组织的发育过程。有研究发现在拟南芥SEP1、SEP2和SEP3 的三突变体中，各轮花器官均转变为萼片，说明它们决定了另外三轮花器官既花瓣、雄蕊和心皮的形态建成，而且这3个基因在功能上是冗余的，这暗示了它们除了在拟南芥花发育早期特异性表达之外，还在各轮花器官的发育过程具有空间特异性。E类基因功能的揭示使ABC 模型在内容上得到极大补充。

近年来，为阐释ABCE四类基因所编码的蛋白产物如何通过相互作用来控制花器官的特征属性，科学家们提出了四聚体模型(quartet model)。该模型认为：高等植物四轮花器官的发育是由A、B、C和E类基因的蛋白质产物所形成的四聚体决定的。在拟南芥中，结合酵母双杂交结果，人们发现：AP1+AP1+SEP+SEP(A类+E类基因)决定萼片的形成， AP1+AP3+PI+SEP(A类+B类+E类基因)决定了花瓣的发育，AP3+PI+AG+SEP(B类+C类+E 类基因)决定雄蕊的发育，AG+AG+SEP+SEP(C类+E类基因)决定了心皮(雌蕊)的发育。该模型的提出将花器官建成的研究转向整体解析诸多花器官决定因子之间的协同相互作用，并以此来解释控制花器官发育的作用机制。

由此可知，以SEP基因为代表的E类基因与ABC模型中的成员A、B、C三类基因的共同表达对于高等植物花器官特性的建成与维持是必不可少的。此外白桦(Betula platyphylla Suk) 花单性，雌雄同株，花器官高度退化，是典型的不完全花。同年生雌雄花花期不遇，且雄花发育过程中存在着越冬宿存现象，这些均与拟南芥、金鱼草和矮牵牛等模式草本植物花的发育模式有着显著差异，这可能是由多年生木本植物特有的控制花器官发育的下游基因与调控系统所造成的，因此，深入研究其发育机制对于高等植物的花发育机制具有着重要的意义。

本研究以白桦雌雄花为材料，克隆分离了白桦SEP1基因的全长编码序列，利用实时定量 PCR技术研究白桦SEP1基因的组织表达特征，并将其过表达转化拟南芥，观察转基因植株的差异表型，试图研究白桦这一特殊物种中E类基因在高等植物花器官发育过程中发挥的功能和作用，也可为E类基因在其他木本植物花器官发育过程中发挥的重要作用做出合理的预测。

发明内容：

本发明提供一种从白桦中克隆白桦花发育相关基因BpSEP1的方法：

(1)先采用改良的CTAB-LiCl法提取白桦花序总RNA，经过DNase I消化和纯化后，按照TaKaRa公司RNA PCR Kit(AMV)试剂盒的方法合成cDNA的第一链。

(2)5'RACE和3'RACE按照TaKaRa公司试剂盒说明书进行。再将PCR的扩增产物进行胶回收，回收目的片段与T载体连接，转化大肠杆菌，然后测序。

(3)将5'RACE和3'RACE PCR获得的序列进行拼接后，利用引物SEP1-F1和SEP1-R1进行PCR 检测，检测正确后，所获得的全长cDNA，命名为白桦BpSEP1；其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明构建了白桦 BPSEP1基因的植物表达载体，构建的植物表达载体(pROK II-BpSEP1)经农杆菌浸染拟南芥植株，获得转基因拟南芥植株；其中转基因纯系植株表型有明显变化，如部分转基因植株侧枝着生的托叶的位置发生变化，呈现为对生叶，以及侧枝呈现为单向分支，部分转基因植株花的形态出现异常，花序不再进行发育；暗示BpSEP1基因既在侧生器官发育过程中产生影响也在花器官的发育过程中起到调控作用，此外转基因拟南芥的开花时间与野生型相比也略微提前。