[发明专利]一种快速提取果实果肉中细胞壁酸性转化酶的方法

说明书

本发明公开了一种快速提取果实果肉中细胞壁酸性转化酶的方法。以果实果肉为原料，经液氮研磨后加入预冷的提取缓冲液，离心后得到的沉淀采用洗涤液多次反复洗涤，去除可溶性蛋白质，再将洗涤后得到的沉淀中加入洗脱液，进行超声波处理，并保持整个超声处理过程中水浴温度0～4℃。超声处理结束后，离心获得的上清液即为细胞壁酸性转化酶的粗酶提取液。本发明提取所得提取液中细胞壁酸性转化酶的活性与常规24 h振荡提取出的细胞壁酸性转化酶的活性无显著差异性，且该方法简便、快速、低耗，适合各种果实中细胞壁酸性转化酶的提取，所得提取液可用于细胞壁酸性转化酶活性分析。

技术领域

本发明涉及一种提取果实中细胞壁酸性转化酶的方法，属于生物化学领域。

背景技术

果实中糖分的含量、组分种类及各成分的所占比例是决定果实甜度及风味品质的关键因素，也是类胡萝卜素、维生素、色素和芳香物质等合成的基础原料，还参与新陈代谢、能量供给，并在细胞转导中起着信号分子的作用。蔗糖是决定果实甜度的重要因子，果实中蔗糖的积累与其相关代谢酶活性有关。蔗糖转化酶广泛存在果实中，根据其pH值和亚细胞的定位不同分为3类：可溶性酸性转化酶（S-AIV），中性转化酶（NINV）和细胞壁转化酶（CWINV）。细胞壁转化酶（CWINV）为不溶性酸性转化酶，被认为是关于蔗糖卸载的关键酶；该酶通过保持蔗糖和库组织之间蔗糖浓度梯度而在光合产物的运输上起着重要作用。常用的细胞壁转化酶的提取方法中采用长时间（24h）的振荡处理，从而使细胞壁转化酶从细胞壁中提取出来，不仅耗时长，而且需要长时间的保持低温过程，耗能较大。

超声波是指频率在2×10⁴—2×10⁹ Hz的声波，是高于正常人类听觉范围的弹性机械振动。超声波自1830年首次产生后广泛应用于食品、医疗卫生、生物分子的提取等许多领域；超声波提取可实现击破细胞壁，高效和快速提取细胞中内溶物的过程。超声波提取是利用超声波的空化作用、机械作用、热效应等以增大分子运动频率和速度，增加溶剂的穿透力，从而提高目标成分浸出率的方法。它具有省时、提取效率高等优点，是一种快速、高效的提取方法。目前，将超声波处理技术用于提取果实中细胞壁酸性转化酶还未见报道。

发明内容

本发明针对目前细胞薄壁转化酶提取时间过长的不足，提供了一种快速、简便提取果实细胞壁酸性转化酶的方法，为细胞壁转化酶活性的测定提供粗酶提取液。

为实现以上发明目的，本发明采用的技术方案是提供一种快速提取果实细胞壁转化酶的方法，在温度为0～4℃的条件下，包括如下步骤：

1．分别配制提取缓冲液Ⅰ,Ⅱ和洗脱缓冲液：

提取缓冲液Ⅰ为150 mm Tris-HCl pH 8.0 ，10 mm MgCl₂，2 mm EDTA，0.1 mmPMSF，0.2% v/v β-巯基乙醇，1 mm 苯甲脒，3% w/v PVPP 和10 mm 抗坏血酸；

提取缓冲液Ⅱ为150 mm Tris-HCl pH 8.0，10 mm MgCl₂，2 mm EDTA，0.1 mmPMSF，0.2% v/v β-巯基乙醇，1 mm 苯甲脒， 10 mm 抗坏血酸；

洗脱缓冲液为150 mm Tris-HCl pH 8.0 ，0.5 m NaCl，10 mm MgCl₂，2 mm EDTA，0.1 mm PMSF，0.2% v/v β-巯基乙醇，1 mm 苯甲脒， 10 mm 抗坏血酸；

2．将果实果肉样品研磨后，加入提取缓冲液Ⅰ，经冷冻离心处理，去除上清液，获得沉淀；

3．用提取缓冲液Ⅱ反复洗涤沉淀，去除蛋白质；

4．将洗脱缓冲液加入到步骤3获得的沉淀中，在超声波频率为40KHZ，功率为100W的条件下，超声提取2～3 h，再经离心处理后得到的上清液即为果实果肉中细胞壁转化酶的粗酶提取液。