[发明专利]利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫球蛋白制备领域，具体涉及一种利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法。

背景技术

哺乳动物的免疫系统是最万能的生物系统，因为可以产生超过多个抗体特异性。在个体动物中，存在至少5,000-10,000个能够产生独特抗体的不同B-细胞克隆。此外，由于抗体多样性产生过程中体细胞突变的过程，本质上可以产生无限数量的独特抗体分子。实际上，当前的生物和医学研究中有许多是针对开发这个库(repertoire)。抗体的主要功能是与抗原(包括外来的和自身的)相结合，从而有效地清除侵入机体内的微生物、寄生虫等异物，尤其是单克隆抗体，由于其高度均一、针对某一特定抗原表位，因此，广泛用于免疫学分析、放射免疫显像和免疫导向治疗等领域。

1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲的特征，既能像骨髓瘤细胞一样在体外培养中无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来个单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody)，简称单抗。但是这一技术的主要缺点就是体外筛选过程中，由于能分泌特异性抗体的B淋巴细胞只占极少数，因而效率较低，耗费大量的人力物力。

人工淋巴结技术在2007年日本科学家Takeshi Watanabe发现的，在不具备免疫原性的生物材料上包被基质细胞和树突状细胞(DC cells)，再将包被好的材料移植到小鼠肾盂囊下，经过抗原免疫后，这些生物材料会形成包含分泌抗体的B细胞的小结节，即所谓人工淋巴结(Artificial lymph nodes)。这项技术可以使那些本来缺乏或者丧失免疫功能的小鼠重新获得部分或者全部的免疫功能，因而有着很大的应用前景。

目前还没有将这一技术用于生产单克隆抗体。因此开发一种利用这一人工淋巴结技术与杂交瘤细胞技术相结合的生产方法，就能大大提高抗体的生产效率，缩短抗体生产时间。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法，本发明的方法将人工淋巴结技术与杂交瘤细胞技术相结合，生产出大量的能产生针对特异性抗原的抗体的B淋巴细胞，获得阳性克隆的效率更高，大大提高抗体的生产效率，节省了成本。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法，包括以下步骤：

1)人工淋巴结的制备；

2)将人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠体内，给予目标抗原免疫刺激，获得表达目标抗体的B淋巴细胞；

3)分离出步骤2)获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得产生特异性抗体的单克隆细胞，得单克隆抗体。

本发明的方法将人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠的体内，由于免疫缺陷型小鼠缺乏免疫性，这些移植的人工淋巴结就能够在免疫缺陷小鼠体内大量扩增，生产出大量的能产生针对特异性抗原的抗体的B淋巴细胞，大大提高抗体的生产效率，缩短抗体生产时间。人工淋巴结包含了数量巨大的针对特异性抗原的B淋巴细胞，因而在与骨髓瘤细胞融合后获得阳性克隆的效率更高，可以不必像传统方法那样通过大批量的筛选才能获得阳性克隆，从而节省了人力与物力成本。

进一步，步骤1)中人工淋巴结的制备为：将包被了基质细胞和树突状细胞的生物材料移植到小鼠体内，经过目标抗原的免疫后，得人工淋巴结。

作为一种优选，包被到生物材料上的细胞浓度为1×10⁷/ml。

所述生物材料为天然生物材料或合成的可生物降解材料；所述天然生物材料包括但不仅限于胶原、聚糖以及生物衍生材料；所述合成的可生物降解材料包括但不仅限于聚酯类、聚乙二醇类以及聚氨基酸类。

作为一种优选，所述包被了基质细胞和树突状细胞的生物材料直径约为50-300um。

进一步，步骤1)中生物材料的移植为移植到小鼠肾盂囊下。

在不具备免疫原性的生物材料上包被基质细胞和树突状细胞(DC cells)，再将包被好的材料移植到小鼠肾盂囊下，经过抗原免疫后，这些生物材料会形成包含分泌抗体的B细胞，即所谓人工淋巴结(Artificial lymph nodes)。

进一步，步骤1)中的小鼠为BALB/c小鼠；经过目标抗原的免疫分4次完成。